葡萄糖調節蛋白78與腫瘤內質網關系研究進展

李瀟 王靜 董尚林 武彩霞 劉開揚

葡萄糖調節蛋白78(GRP78)已被證明是內質網(ER)中的一種分子伴侶，其主要任務是響應細胞的內質網應激(ERS)，促進蛋白質折疊、組裝、轉運、調節ER跨膜傳感器和維持鈣穩態。在各種病理狀態及內外環境刺激下，未折疊和錯誤折疊的蛋白質發生碰撞，于是細胞啟動未折疊蛋白反應(UPR)進行自我保護。一般而言，GRP78與橫跨ER膜的3個傳感器相結合并同時處于失活期。這3個跨膜傳感器分別是肌醇需求酶1(IRE-1)、蛋白激酶樣內質網激酶 (PERK)以及激活轉錄因子6(ATF6)。當發生ERS時，GRP78與這3個傳感器被激活，在抑制蛋白質合成同時降低了蛋白質錯誤折疊率，GRP78跨膜轉運蛋白的能力也隨著ER膜通透性的增加而增強，這更有利于堆積蛋白的跨膜轉運。如此，便可有效控制和緩解ERS。若應激狀態未被有效控制，PERK和IRE1信號便會激活并介導內質網步入凋亡程序。由于PERK與GRP78解離并活化，促凋亡的CCAAT/增強子結合蛋白表達也有所升高。IRE1的激活剪接了X-box-binding protein 1(XBP1)mRNA，促使細胞存活。同時，IRE1募集TNF受體相關因子2和凋亡信號調節激酶1，然后激活c-Jun N端激酶(JNK)并誘導凋亡。GRP78作為中央調節劑，不僅在正常細胞和腫瘤細胞中都有表達，且表達水平在腫瘤細胞中相對較高。由此猜測腫瘤易復發、易轉移等特性或許與之有關[1]。

1 GRP78結構

GRP78雖然只有小塊疏水斑塊，但這些小疏水斑塊對于它的功能是必不可少的，因為可識別出針對退化或折疊機制出現問題的未折疊蛋白。GRP78的結構分為氨基末端的ATP結合域(ABD)(或核苷酸結合域NBD)和羧基末端的底物結合域(SBD)。在人類基因中，由功能性基因和假基因(基因處理)來編碼GRP78。功能基因包含8個外顯子。偽基因不參與基因轉錄，它位于基因組AT富集區。功能基因啟動子由近端和遠端兩部分組成。遠端結構域負責增強基礎表達水平，近端結構域負責對細胞的各種刺激做出反應。功能基因的GRP78啟動子包含一個TATA 框和5個CCAAT序列。從5’端開始，TATA盒位于上游25個核苷酸處，CCAAT序列位于RNA起始位點上游250個核苷酸之內。在基因的3’端，發現了聚腺苷酸化序列AATAAA[2]。 GRP78在幾乎所有生物體中表現為高度保守特性,反映出其在細胞存活中的核心地位，在維持ER穩定、協調蛋白質跨膜轉運方面具有不可替代性[3]。

2 GRP78ERS

ER是一個動態結構，對于細胞鈣存儲、蛋白質合成、脂類和糖類代謝等一系列生物學過程有著至關作用。當ER生理功能發生紊亂如氧分壓降低、病毒感染、營養缺乏、快速細胞增殖、氧化還原失衡、Ca2+水平降低、蛋白質糖基化改變或蛋白質折疊缺陷會導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質積聚在ER內腔中，這種有害的情況被稱為ERS，威脅到細胞的功能和生存[4-6]。為響應細胞應激，激活完善的信號級聯反應，重建細胞動態平衡和減輕刺激壓力，便出現了UPR[5]。

UPR是一個明確定義的過程，在潛在的毒性錯誤折疊蛋白的積累之后恢復內穩態方面扮演重要角色。UPR由蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)，激活轉錄因子6(ATF6)和肌醇需求酶1(IRE1)這3個傳感器調節。所有這3個激活由不同的換能器介導的專門轉錄程序-ATF4，裂解的ATF6和剪接的XBP1。這些因子直接激活伴侶蛋白或在氧化還原穩態，蛋白質分泌，脂質生物合成或細胞死亡程序中起作用的蛋白質的轉錄[6]。

ERS的過度使得ER功能受損，隨著其延長，為保細胞正常更新，免疫系統正常發育等，凋亡便不可避免[7,8]。在這個過程中，Caspase-12參與ERS介導的細胞凋亡。當過大的ERS被觸發時，從ER活化成細胞質的Caspase-12，然后激活胱天蛋白酶9伴隨著Caspase-3,最終觸發ERS介導的凋亡[9]。而啟動凋亡通路通常有PERK/eIF2a/CHOP通路、IRE1/TRAF2/CJNK 通路、Ca2+/Caspase12通路等[7]。

3 GRP78、腫瘤與ER

在腫瘤進展過程中，癌細胞會發生許多特征性變化。如獨立于外源性生長促進或生長抑制信號增殖；侵入周圍組織并轉移到遠處；引發血管生成反應以及逃避限制細胞增殖機制(例如凋亡和復制性衰老)的能力。這些特性反映了正常細胞中控制細胞增殖、運動性和存活的細胞信號傳導途徑的改變[10]。另外，腫瘤細胞為了適應低血低營養的環境，會啟動未折疊蛋白反應以有效的轉運出堆積的蛋白，來適應ERS而避免應激引起的凋亡[11]。GRP78在許多實體瘤中均有較高的表達水平，提示了我們GRP78的表達程度與腫瘤的發生以及演變有著密不可分的關系[12]。據報道在上述大多數癌癥類型中，如若使用抑制劑抑制GRP78的表達或消除GRP78可增強化療的效果來誘導細胞凋亡[13]。

3.1 GRP78與胃癌(GC) GC在世界范圍內被列為最常見的癌癥相關死亡原因之一，胃切除外加區域淋巴結清掃是Ⅰ～Ⅲ期GC治療的常用方法，但約有20%～30%的患者在術后依舊會發生遠處轉移或局部復發，即便進行了及時的治療也無法避免死亡。GRP78在早期疾病患者中表達較強；但在晚期患者中表達較弱，提示在ERS條件下形成低度惡性細胞，那么高度惡性細胞卻可以“靈活的”避開凋亡繼續生長[14]。

即便是ERS在GC細胞凋亡方面的作用不甚強大，但依舊可使得部分腫瘤細胞進入凋亡狀態。這是因為ERS可以迅速的激活ERK1/2，GRP78相應表達提高，caspase依賴途徑同時增強了細胞的凋亡。而在對抗ERS誘導的細胞凋亡方面GRP78似乎有著關鍵的作用。因此，ERS激活MEK/ERK是誘導GRP78所必需的，GRP78可保護處于ERS狀態的胃癌細胞不發生凋亡[15]。由此，GRP78可能成為研究GC的一個新入手點。

3.2 GRP78與肺癌 約80%的肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)亞型。肺組織的腫瘤形成過程取決于吸入煙霧和空氣污染。NSCLC的主要病因是吸煙。ERS是暴露于環境毒素、缺氧、感染源或錯誤折疊蛋白積累后肺部的一種自然反應。大量錯誤折疊的蛋白質無法正常轉運出內質網，這時ER的重要調節者——GRP78激活，協調內質網的UPR，維持ER腔內平衡。ERS和UPR在調節肺細胞內的動態平衡方面發揮著核心作用。GRP78作為ER網伴侶，在調節UPR中具有十分重要的地位[16]。在腫瘤細胞的轉移中，甚至是淋巴結中都存在高表達的現象。如果敲低GRP78的表達，則腫瘤的侵襲速度和轉移狀況都得到了明顯的好轉[17]。腫瘤的生長依賴于UPR作為驅動惡性轉化的選擇性力量，除了重塑腫瘤微環境和抗癌免疫反應外，還影響癌癥的其他標志。ERS和UPR信號的過度激活已經成為肺癌等一些疾病的顯著病理特征[18]。藥理學上持續誘導或抑制UPR可能對NSCLC有治療作用[16]。

3.3 GRP78與食管癌 目前已有不少臨床研究將對ERS信號的操縱確定為食管癌的治療靶點，究其原因是食管癌的發生可由ER的應激現象所引發。GRP78是其定位在所有真核細胞的ER膜上的熱休克蛋白家族成員，在ERS刺激下，GRP78呈現高表達態勢，并通過調節跨膜ERS傳感器在細胞存活和凋亡中起重要作用，而ERS主要是由ER分子伴侶GRP78蛋白介導的[17,19]。在正常食管組織中GRP78基本上呈陰性表達，而在癌前病變及原位癌中，GRP78陽性強度較高。然而在鱗癌 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級中GRP78基本上呈弱陽性表達，且陽性率均為50%左右[20]。趙國華等[21]研究表明與食管鱗狀細胞癌(ESCC)非轉移細胞相比，轉移程度高的細胞中GRP78的表達水平顯然更高。GRP78可能通過調節MMP-2和MMP-9的表達作為ESCC患者潛在的預后和治療標記。可成為未來改善患病患者的預后狀況，并產生個性化的癌癥治療新的靶點。

4 GRP78與癌癥抗藥性

ERS可以在腫瘤細胞和巨噬細胞中驅動促炎程序，從而促進腫瘤的病情進展。腫瘤細胞處于應激狀態下將分泌介質以刺激巨噬細胞分泌促炎細胞因子，使得腫瘤細胞的促炎反應進一步加大。另外，腫瘤細胞的生存也必然需要抵抗宿主的免疫防御。GRP78在腫瘤組織中的高表達狀態對腫瘤抗藥性和腫瘤免疫逃逸方面起著重要的作用。T細胞亞群是具有調節人體免疫的功能，作為這個家族成員的調節性T細胞(Tregs)，特征是獲得促炎性細胞因子分泌和抑制活性降低。在一些癌癥中，Tregs表達率的升高將幫助腫瘤細胞逃脫免疫控制，進而促進腫瘤的生長，最終表現為加劇了ERS。

目前，GRP78已被廣泛證明可使人對多種療法產生耐藥性，包括化療藥物、抗激素藥物、DNA損傷劑、抗血管生成藥物和染色質修飾藥物，以及放射治療[22]。研究表明，GRP78的表達通常在腫瘤的發生和發展中是上調的，這不但不能幫助腫瘤細胞快速凋亡，還會出現腫瘤細胞不受控生長的現象，同時加劇了腫瘤耐藥性、內部復發以及外部的轉移[23]。已有文獻闡明，隨著乳腺癌臨床分期的延后，腫瘤細胞ERS的程度也隨之加劇，導致了GRP78表達上調，這促進了細胞增殖和遷移，抑制了Bcl-2 的表達，使得腫瘤細胞凋亡不足進而發生不受控生長的現象。同時，GRP78與激活的凋亡上游因子caspase-7 的結合，此時的caspase-7是不會發生分解反應的，這使得細胞凋亡受到抑制，從而影響了乳腺癌患者的預后和化療效果[24]。同樣的，抑制MDA-MB-231細胞在GRP78中的表達，促進了凋亡基因的Bax轉錄的上調和凋亡抑制基因Bcl-2轉錄的下調，進而促進了MDAMB-231細胞凋亡，以治療乳腺癌[22]。對一系列原發性和復發性乳腺癌，前列腺癌和肺癌樣本中的GRP78的初步分析共同表明，GRP78是人類癌癥中腫瘤生長和耐藥性的主要“貢獻者”[25]。

目前，大部分癌癥的治療方法依舊以化療為主，雖然GRP78導致的耐藥性成為了目前治療上的阻力，但GRP78似乎又可以成為某些化療藥的正性誘導劑。例如，順鉑在較多的癌癥治療中都有應用，但它的耐藥性卻成為讓眾多研究者很頭痛的缺陷，這在很大程度上限制了順鉑在臨床上的應用和療效。順鉑耐藥的基本細胞和分子機制是復雜的，通常與DNA甲基化、microRNA圖譜、腫瘤干細胞特性和應激反應伴侶蛋白表達的改變有關[26]。它的作用方式與它與DNA上的嘌呤堿基交聯的能力有關。干擾DNA的修復機制，會激起DNA的損傷，最終將發展到細胞的凋亡[27]。迄今為止，順鉑耐藥性的已知機制包括調節促凋亡和抗凋亡蛋白，藥物轉運，排毒和DNA修復[28]。研究發現，“GRP78高表達能夠提高細胞對順鉑的敏感性”主要與DNA交聯修復有關。一方面，GRP78能夠減慢DNA交聯產物從細胞內脫失的速度；另一方面，GRP78還能夠削弱DNA加和物切補修復，從而導致DNA交聯產物在細胞內滯留時間延遲，增強藥物的敏感性[29]。

通過激活ERS信號通路和自噬信號通路，上調ERS和自噬的相關指標也可提高細胞對順鉑治療的化學敏感性[30]。像是鼻咽癌NPC，它的主流方法是放射療法，加入順鉑輔助化療，可以有效減少腫瘤復發，提高鼻咽癌細胞對順鉑的敏感度可通過抑制GRP78高表達[31]。乳腺癌，膀胱癌，腦癌等都廣泛應用順鉑作為抗癌藥物，但其毒副作用不可忽視，需在治療中密切關注。

5 GRP78與ERS、腫瘤微環境的關系

腫瘤微環境是一個構成復雜的嚴密系統，腫瘤相關間質細胞、免疫炎性細胞和低血供生長條件共同構成“腫瘤微環境”。在腫瘤進展過程中，微環境改變是通過分子和細胞，涉及早期癌細胞和宿主結構以及適應性和先天免疫細胞之間的相互作用。腫瘤細胞與腫瘤微環境的相互作用在腫瘤的生長、代謝和遠處轉移的調控中占有不可忽視的地位。在這個過程中，癌細胞獲得了一系列的特征，這些特征被總結為“癌癥的十大特征”，并被描述為：(1)基因組不穩定和突變，(2)促進腫瘤的炎癥，(3)維持增殖信號，(4)逃避生長抑制因子，(5)抵抗細胞死亡，(6)使復制不朽，(7)誘導血管生成，(8)激活侵襲和轉移，(9)重新編程能量代謝，(10)逃避免疫破壞。這些特征與腫瘤微環境之間的關系是密不可分的，而分析表明特定的致癌途徑可能與腫瘤微環境的劇烈變化有關[32,33]。如缺乏的營養，氧氣的不足，增高的代謝水平，過度的ERS，將同時影響腫瘤微環境和蛋白質在ER的折疊能力，從而引起細胞的ERS。GRP78是眾所周知的ER滯留伴侶，但也被發現存在于腫瘤細胞的細胞膜、細胞質、細胞核、線粒體以及細胞分泌物中，并且能改善腫瘤ERS狀態[34]。

5.1 GRP78與微環境 腫瘤細胞與其環境之間是相輔相成的，在良好的微環境中腫瘤細胞自然生長迅速，相反，觀察到腫瘤細胞生長狀況也可側面反映出腫瘤微環境的情況。

重要的是，一些證據表明，在多步驟腫瘤形成過程中，位于不同細胞位置的GRP78有助于獲得腫瘤標志[23-26]。腫瘤細胞通常會侵入或轉移到異物環境中，例如缺氧，葡萄糖缺乏，乳酸性酸中毒，氧化應激和氨基酸供應不足等，這些不利條件將大大影響蛋白在ER中折疊的情況，彼時會出現ERS并伴隨著UPR。

ER隔室中GRP78的增加，加速了GRP78進入細胞表面的進程，GRP78新的共受體功能，可用于細胞表面的信號傳導。腫瘤微環境包含大量支持腫瘤生長和進展的細胞。我們最近的研究還發現，在腫瘤脈管系統中同樣發現了GRP78，表達量競一度很高，這便強調了這些腫瘤相關內皮細胞的激活處于恒定狀態。我們進一步證明GRP78是內皮細胞增殖，存活和遷移的重要介質；這為腫瘤生長和轉移過程中微環境中GRP78的需求提供了新的解釋[33,35,36]。

5.2 ERS與微環境 ERS是細胞對環境因子的一種重要反應，可由腫瘤微環境改變或抗腫瘤藥物誘導。ER應力傳感器的持續激活賦予惡性腫瘤細胞更大的致瘤性，轉移性和耐藥性。最近研究發現，ERS通過操縱腫瘤微環境中髓樣細胞的功能進一步阻礙了保護性抗癌免疫力的發展。盡管存在許多細胞內在和外在應激，但ER可通過協調廣泛的基本細胞過程來提高這種適應能力。多種細胞內源性和外源性機制在腫瘤細胞和較大的腫瘤微環境內引發和放大ERS。在大多數主要類型的人類癌癥中都有強有力的ERS，原位ERS常與晚期病癥和化學抗性有著微妙的關系。耐受持續的ERS能力增強了腫瘤細胞的存活、血管生成、轉移能力、耐藥性和免疫抑制力，這將激活腫瘤細胞的UPR。UPR的激活，將UPR從細胞保護轉化為細胞毒性，而UPR的激活程度在腫瘤生長狀態和發展情況中起著重要的早期作用；隨著腫瘤的生長，缺氧、營養剝奪和治療誘導的應激可能對UPR的激活起著越來越大的作用。作為重要伴侶的GRP78，在UPR激活中充當主要傳感器。

但是諸如化學療法之類的抗癌干預措施也可以調節UPR信號傳導。癌癥的發生和發展都需要使腫瘤抑制因子失活和(或)獲得使細胞增殖，生長因子介導的調節脫鉤的致癌突變。蛋白質合成中與轉化相關的增加常常使ER蛋白的折疊能力不堪重負。因此，高度分泌的癌癥，例如產生極高水平免疫球蛋白的B細胞惡性多發性骨髓瘤，經常遭受持續的ERS[34,36.38]。

6 GRP78與溶瘤病毒的腫瘤治療

溶瘤病毒就是有腫瘤殺傷能力，還同時具有十分強大的復制能力。它對腫瘤細胞特異性的識別并摧毀和在正常細胞內無法復制的特性使其成為時下研究中非常熱門的抗腫瘤藥物。很多病毒僅因為其嗜腫瘤特性而轉變為溶瘤病毒，如使家禽業遭受重創的新城疫病毒(NDV)，能同時感染人和動植物的呼腸孤病毒(reovirus)等。

6.1 溶瘤病毒對癌細胞糖代謝影響過程中與GRP78 ER調節的關系

腫瘤通常是由不適當的基因表達引起的，這導致了該病特有的不受抑制的細胞生長。其中腫瘤細胞的一大特點是出現了葡萄糖代謝的變化。該特性使得它瘋狂侵食體內葡萄糖，即使是在氧氣充足的情況下，腫瘤細胞也可以將葡萄糖代謝轉變為糖酵解，乳酸產生速率隨之提高。通常將其稱之為 “沃伯格效應”。低灌注的實體腫瘤長期處于缺糖、缺氧和酸中毒等因素的作用下創造出的一個相對缺乏營養的微環境，ERS信號會在此種情況下被激活。ERS信號的激活，刺激了GRP78的表達量高于尋常，將會導致葡萄糖的剝奪從而引起腫瘤細胞的存活。

而溶瘤病毒對腫瘤細胞的直接裂解，會釋放出可溶性抗原，能夠修復腫瘤微環境，改善血流缺損和缺氧的狀況，從而驅動機體恢復抗腫瘤的免疫力。同時溶瘤病毒降低腫瘤細胞ATP、丙酮酸活性，使機體糖酵解的速率得以緩慢的恢復平穩，緩和了腫瘤微環境的平衡，還一并制止了GRP78的高表達，達到了遏制腫瘤細胞的目的。

如今，通過選擇一種對人類無毒力的病毒或通過改造病毒基因組來實現腫瘤細胞特異性復制的嘗試已經開始，且在腫瘤治療方面取得了突破性進展，溶瘤病毒已然成為一種有效的抗癌藥物[33,39-44]。

6.2 溶瘤病毒誘導癌細胞凋亡過程中與GRP78內質網調節的關系 凋亡，是確保細胞保真度和增殖質量不出現故障的安全措施，是凈化機體內環境所進行的由基因調控的自主選擇性的死亡，稱為程序性細胞死亡(PCD)，具有復雜的調控系統。在遭受ERS的情況下，內質網的主要調控物質GRP78會被迅速喚醒，以緩解UPR并維持內質網環境的穩態。正常情況下，caspase-12處于休眠狀態，并長期受到GRP78的抑制以阻止細胞凋亡現象的發生。當應激狀態無法緩解對細胞的損傷時候，ERS將啟動凋亡機制，進一步激活PCD。癌癥的標志之一是細胞凋亡的逃避，這意味著細胞的無限復制潛能使細胞凋亡不足。抑癌基因的突變，這也是腫瘤細胞源源不斷生長的一大重要原因。例如，p53是人體重要的抑癌基因，腫瘤發生可能在抑癌基因p53突變，預防系統出現故障或完全失去功能情況下。而p53可以通過激活促凋亡因子(例如Bax，casepase)，同時抑制抗凋亡因子(例如Bcl-2)來為凋亡鋪平道路。同時，細胞ATP的含量也可以反映其健康狀況，高水平的ATP表明細胞是健康的。相反，ATP含量的減少將是宿主細胞死亡的信號。凋亡的形態十分多樣，因此從其形態學和生化特征也可使人們很容易將其與其他類型的細胞死亡區分開來[45,46]。

Caspase-12作為凋亡因子caspase家族的重要成員，因ERS的發生，它便與ER膜分離并在ERS時裂解為活性片段，導致了細胞凋亡。在遭受強大的ERS情況時，GRP78可在UPR中被滴定掉，以激活UPR并減輕細胞壓力。UPR的激活通過減少進入ER的蛋白質和選擇性合成折疊的蛋白質組分來促進細胞存活。然而，ER壓力的持續存在，GRP78的持續上調，內穩態長期無法恢復時，將引發UPR。過度及長時間的ERS激活了caspase-12，觸發了細胞自殺[47-50]。

溶瘤病毒因其獨特的選擇性治療特點而受到國內外的矚目，它可感染和殺死不同類型的腫瘤細胞，是一種新興的生物治療癌癥手段。由于腫瘤細胞中病毒載量的增加，腫瘤細胞便進入凋亡程序，甚至可以是壞死。有研究發現，在感染了病毒的PC12細胞中檢測到caspase-12的激活。尤其是近年來大熱的新城疫病毒。新城疫病毒(NDV)屬于副粘病毒科Averavirus屬。這個家族的病毒是包膜的、無節段的、負義的RNA病毒，在各種禽類中引起呼吸道和胃腸道的炎癥。NDV強毒株仍在包括伊拉克在內的不同國家引發疫情，這在全世界家禽業的發展中都是一個無法令人忽視的潛在威脅；然而，毒理減弱后的慢傳播型NDV在實驗室動物中具有良好的抗腫瘤活性和極好的安全性。NDV通過內在和外在途徑誘導癌細胞凋亡，導致DNA斷裂和Fas配體表達。此外，該病毒可通過caspase依賴和獨立的途徑誘導癌細胞凋亡。發現溶瘤新城疫病毒株干擾生物癌細胞提高糖酵解率以滿足其生存所需的能量需求，且未觀察到對正常細胞產生不良的影響。總之，溶瘤NDV降低腫瘤細胞糖酵解途徑活性的能力可能是改進抗腫瘤治療的一個令人興奮的模塊[51-53]。

綜上所述，GRP78不僅在維持正常細胞功能方面起著關鍵作用，還與腫瘤的發展趨勢有著密不可分的關系。多項研究表明，雖然GRP78的重要地位不言而喻，但其在正常細胞中的表達量卻是微乎其微，而在腫瘤細胞中的過表達竟構成了腫瘤的耐藥性機制，這使得GRP78在腫瘤抗藥性及其特異性抑制劑和靶向藥物研究方面具有著很大的前景。雖然GRP78對腫瘤ER影響的機制還未被完全闡明，但從諸多前輩們的研究中可發現，GRP78可成為今后研究腫瘤臨床治療的新的突破口。在細胞水平抑制GRP78表達并聯合放化療等治療措施，有希望成為未來腫瘤治療的新模式。