LncRNA FGFR3-AS1在卵巢癌中的預(yù)后及對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的影響

高婉 李亞萍 王燕

卵巢癌(OC)是一種常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來(lái)OC的發(fā)病率也呈越來(lái)越高的趨勢(shì)[1,2]。很多OC患者的早期癥狀并不明顯，這導(dǎo)致很多患者一經(jīng)確診就是晚期，并且對(duì)于OC的治療多采用傳統(tǒng)的手術(shù)結(jié)合放化療治療，雖然這可以在一定程度上延長(zhǎng)壽命，但是由于腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高，預(yù)后仍較差[3,4]。因此探尋OC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找能夠有效預(yù)測(cè)OC患者預(yù)后的分子靶點(diǎn)有重要臨床意義。非編碼RNA近年來(lái)被各大領(lǐng)域不斷探索，目前人們認(rèn)知的非編碼RNA有l(wèi)ncRNA(long non-coding RNAs)，miR(microRNA)，circRNA(Circular RNA)[5,6]。LncRNA作為一種長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼長(zhǎng)鏈RNA，最開始被人們發(fā)現(xiàn)時(shí)認(rèn)為其是轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的“代謝廢物”[7]。但隨著科學(xué)水平的發(fā)展，關(guān)于其在腫瘤中的作用的研究越來(lái)越多[8]。并且LncRNA對(duì)于很多腫瘤如肺癌[9]、胃癌[10]的預(yù)后都有著較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。LncRNA-BX537709與FGFR3呈反義方向，形成1 053個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)的“尾對(duì)尾”配對(duì)模式，所以被命名為FGFR3反義轉(zhuǎn)錄本1(FGFR3-AS1)[11]。已有的研究中,FGFR3-AS1被發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤[12]、肝癌[13]等多種腫瘤中存在異常表達(dá)，并且發(fā)揮著促癌基因的作用。但是關(guān)于其在OC中的表達(dá)和作用卻沒有進(jìn)行過研究探究。所以本研究對(duì)FGFR3-AS1在OC中的表達(dá)及其與臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了分析，并且探討FGFR3-AS1對(duì)OC細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)，以期為OC的臨床診治提供更多的靶點(diǎn)方向。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至2018年4月在西安市中心醫(yī)院治療的OC切除術(shù)患者89例作為研究組，另收集同期體檢的正常人75例作為對(duì)照組，本試驗(yàn)已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并同意，所有參與者提供了書面知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者通過病理學(xué)檢測(cè)確診為OC，患者符合2009年頒發(fā)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，患者在本次研究前并未進(jìn)行過抗腫瘤治療，預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并其他惡性腫瘤的、嚴(yán)重感染性疾病、器官功能障礙、心腦血管疾病的患者。手術(shù)過程中收集患者腫瘤組織，并收集對(duì)照組與患者組外周血通過離心后收集血清即刻送入實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人OC細(xì)胞系SKOV3，A2789購(gòu)買自ATCC。細(xì)胞在含10%FBS的RPMI-1640中培養(yǎng)。對(duì)于FGFR3-AS1的過表達(dá)，將FGFR3-AS1構(gòu)建成pcDNA3.1載體(pcDNA3.1-FGFR3-AS1)，pcDNA3.1空載體作為對(duì)照(pcDNA3.1-victor)，為避免脫靶效應(yīng)的小干擾RNA轉(zhuǎn)染，針對(duì)FGFR3-AS1的siRNA由上海基因制藥有限公司設(shè)計(jì)合成的3個(gè)靶向特異性siRNA組成(si-FGFR3-AS1-#1，si-FGFR3-AS1-#2，si-FGFR3-AS1-#3)。將構(gòu)建合格的SKOV3和A2789細(xì)胞以3×105個(gè)/ml的密度接種到6孔板中，使用Lipofectamine 2000(Invitgen，Carlsbad，CA，USA)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 FGFR3-AS1表達(dá)檢測(cè)(qRT-PCR) TRIzol提取樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s，95℃變性30 s，60℃退火延伸40 s，總共40個(gè)循環(huán)。采用GADPH作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參,2-ΔΔct對(duì)本次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[14]。FGFR3-AS1 上游引物:5’-CCACCTCAGGAACCCACAAG-3’,下游引物:5’-GCAGCAGCACCGAAAGTCAC-3’。

1.4 增殖檢測(cè)(CCK-8) 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞并制備細(xì)胞懸浮液，并將其中的細(xì)胞密度調(diào)整為4×104細(xì)胞/孔，后轉(zhuǎn)移至96孔板中，然后在24、48、72、96 h加入10 μl細(xì)胞計(jì)數(shù)試CCK-8試劑(Beyotime Biotechnology，Shanghai，CHN)，4 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量光密度值。

1.5 侵襲檢測(cè)(transwell) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞并制備細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞密度調(diào)整為4×104個(gè)，懸于含有1 μg/ml 絲裂霉素C的無(wú)血清培養(yǎng)基中并將其接種于transwell上室中，下室加入10%牛胎血清。37℃培養(yǎng)24 h，擦拭上室未穿過膜表面的基質(zhì)與細(xì)胞，使用PBS沖洗3次，使用多聚甲醛固定10 min，雙蒸水沖洗3次，待其晾干后使用0.5%結(jié)晶紫染色，使用顯微鏡觀察細(xì)胞侵襲情況。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，消化后使用PBS洗滌2遍，加入100 μl的結(jié)合緩沖液，將其配置成1×106個(gè)/ml懸液，依次加入AnnexinV-FITC(中國(guó)上海翊圣生物科技有限公司)與PI，室溫避光孵育5 min，使用FC500MCL流式細(xì)胞儀系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 FGFR3-AS1的臨床價(jià)值 FGFR3-AS1在患者組織或血清中表達(dá)明顯上升(P<0.05)，并且FGFR3-AS1曲線下面積為0.820。根據(jù)其均數(shù)表達(dá)將其分為高表達(dá)組47例和低表達(dá)組42例，高表達(dá)組患者3年生存率明顯降低。見表1，圖1。

表1 FGFR3-AS1表達(dá)水平比較

圖1 lncRNA FGFR3-AS1在OC患者中的臨床價(jià)值；A FGFR3-AS1在診斷OC的ROC曲線;B FGFR3-AS1低表達(dá)患者3年生存率高于高表達(dá)組患者

2.2 FGFR3-AS1與OC臨床病理的關(guān)系 根據(jù)FGFR3-AS1均數(shù)表達(dá)將其分為高表達(dá)組47例和低表達(dá)組42例，F(xiàn)GFR3-AS1表達(dá)和OC患者的臨床病理分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 FGFR3-AS1與患者病理資料之間的關(guān)系 例(%)

2.3 影響OC患者預(yù)后的相關(guān)因素 COX回歸分析發(fā)現(xiàn)FGFR3-AS1、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移是影響患者的獨(dú)立預(yù)后因素。見表3。

表3 COX分析

2.4 敲除FGFR3-AS1可抑制OC細(xì)胞生長(zhǎng) 為了探究FGFR3-AS1對(duì)OC細(xì)胞的影響，我們建立敲除FGFR3-AS1表達(dá)載體si-FGFR3-AS1,并轉(zhuǎn)染至SKOV3和A2789細(xì)胞，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-FGFR3-AS1后細(xì)胞增殖速度明顯受到抑制，細(xì)胞的穿膜數(shù)量明顯減少，凋亡率則增加(P<0.05)。見表4。

表4 敲除FGFR3-AS1對(duì)OC細(xì)胞的影響

2.5 上調(diào)FGFR3-AS1促進(jìn)OC細(xì)胞生長(zhǎng) 在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FGFR3-AS1后細(xì)胞增殖速度明顯受到增強(qiáng)，細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯增多，凋亡率明顯下降(P<0.05)，結(jié)果說(shuō)明FGFR3-AS1可促進(jìn)OC細(xì)胞的生長(zhǎng)。見表5。

表5 上調(diào)FGFR3-AS1對(duì)OC細(xì)胞的影響

2.6 敲低FGFR3-AS1可以抑制PI3K/AKT通路 確定FGFR3-AS1在OC中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，檢測(cè)FGFR3-AS1對(duì)PI3K/AKT通路的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR3-AS1基因敲除顯著抑制SKOV3和A2789細(xì)胞中PI3K和AKT的磷酸化(P<0.05)。見表6、7。

表6 敲除FGFR3-AS1對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

表7 上調(diào)FGFR3-AS1對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

3 討論

由于OC病情發(fā)展較快以及較易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，使得其治療有較大難度[15]。近年來(lái)盡管醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，但是OC患者的存活率仍舊很低，所以迫切需要尋找新穎的生物標(biāo)志物用于OC的早期診斷和治療[16]。在過去有大量證據(jù)表明，lncRNA通過作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，在OC的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[17,18]。

在過去有很多LncRNA被發(fā)現(xiàn)有希望成為OC治療以及預(yù)后預(yù)測(cè)的靶標(biāo)，比如停滯特異性下調(diào)lncRNA CASC2[19]和GAS5[20]被認(rèn)為是OC的一個(gè)有潛力的預(yù)后生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)。還有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MLK7-AS1可以通過調(diào)節(jié)miR-375/YAP1軸來(lái)促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展[21]。但是關(guān)于LncRNA在OC中的作用仍舊需要深入的探究。FGFR3-AS1作為一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，其與人類癌癥的關(guān)系尚未得到較為廣泛的解釋。曾有學(xué)者報(bào)道FGFR3-AS1的誘導(dǎo)敲除阻止了膀胱癌細(xì)胞周期的進(jìn)展，并且可以顯著阻止移植小鼠的腫瘤進(jìn)展[22]。除此之外還有發(fā)現(xiàn)FGFR3-AS1在骨肉瘤中的表達(dá)上調(diào)，且FGFR3-AS1的表達(dá)水平與骨肉瘤患者的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，此外，通過體外實(shí)驗(yàn)，他們還發(fā)現(xiàn)FGFR3-AS1基因的敲除抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展[23]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了FGFR3-AS1在OC組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且也發(fā)現(xiàn)FGFR3-AS1和OC患者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移以及病理分期有關(guān)。為了進(jìn)一步探究FGFR3-AS1對(duì)OC的影響，我們也進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)OC細(xì)胞中FGFR3-AS1的表達(dá)進(jìn)行了調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低FGFR3-AS1的表達(dá)可以顯著抑制OC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，過表達(dá)FGFR3-AS1則觀察到相反的現(xiàn)象，這提示我們FGFR3-AS1在OC中發(fā)揮著促癌基因的作用。

在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)FGFR3-AS1促進(jìn)了OC細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。PI3K/AKT信號(hào)通路作為一條經(jīng)典的信號(hào)通路，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中經(jīng)常被激活，其對(duì)于調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移都有非常重要的作用[24,25]。在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)敲低FGFR3-AS1顯著抑制了OC細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)的激活，這提示我們很有可能FGFR3-AS1可以通過對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控來(lái)影響OC的發(fā)生發(fā)展。過去曾有研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路在OC的發(fā)生發(fā)展中起到了非常重要的作用，有學(xué)者曾報(bào)道抑制鈣激活氯通道ANO1可通過滅活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制卵巢癌的發(fā)展[26]。還有研究發(fā)現(xiàn)血紅素堿通過調(diào)節(jié)LncRNA CASC2-EIF4A3軸和抑制PI3K/AKT/mTOR途徑來(lái)抑制上皮性卵巢癌的發(fā)展[27]。這些結(jié)果均證實(shí)了PI3K/AKT在OC中的作用，但是本次實(shí)驗(yàn)中，我們首次發(fā)現(xiàn)了FGFR3-AS1可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行激活來(lái)促進(jìn)OC的發(fā)生發(fā)展，這對(duì)于后續(xù)的研究有著重要的參考意義。

綜上所述，在OC中呈高表達(dá)的FGFR3-AS1預(yù)示著患者的預(yù)后不良，且可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，其作用途徑可能是通過PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行的；FGFR3-AS1也有可能成為OC潛在的治療和預(yù)后預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。