CD68和CD166在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義

武會斌 王皇建 王云帥 夏添明 李朝輝 韓保衛(wèi)

雖然近年來腫瘤診治技術(shù)取得了巨大進展，但由于晚期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的5年生存率依然很不滿意[1]。因此，研究與CRC進展相關(guān)的分子標志物，尋找新的治療靶點，在改善CRC患者的預(yù)后中具有重要意義。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)由腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞、免疫細胞和細胞外基質(zhì)等間質(zhì)成分及其分泌的細胞因子構(gòu)成[2]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是TME中最豐富的免疫細胞群[3]，腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSCs)生態(tài)位也是TME的重要組成部分[4]。因此，本研究應(yīng)用免疫組化的方法檢測TAMs標志物CD68和CSCs標志物CD166在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的蛋白表達水平，探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為CRC的治療及預(yù)后判斷提供重要參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2019年10月在鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的CRC患者148例。其中男84例，女64例；年齡32～87歲，中位年齡62歲；結(jié)腸癌65例，直腸癌83例；腫瘤直徑<5 cm者78例，≥5 cm者70例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者111例，有淋巴轉(zhuǎn)移者37例；高分化23例，中分化111例，低分化14例；采用AJCC/UICC結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(2017年第八版)[5]對CRC進行分期：T1期15例，T2期29例，T3期67例，T4期37例；Ⅰ期43例，Ⅱ期61例，Ⅲ期33例，Ⅳ期11例。本研究已通過洛陽中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①術(shù)前未接受放療或化療等抗腫瘤治療；②均進行CRC根治術(shù)，術(shù)后病理學(xué)證實為結(jié)直腸腺癌；③臨床資料完整。

1.2.2 排除標準：①合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤者；②術(shù)前或術(shù)后嚴重感染影響預(yù)后者；③隨訪失訪者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器與試劑：倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，免疫組織化學(xué)油筆購自Doko公司，抗原修復(fù)微波爐購自廣東順德格蘭仕公司，孵育盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。兔抗人CD166單克隆抗體、兔抗人CD68單克隆抗體購自美國Abcam公司，二抗購自BOSTER生物公司，DAB顯色試劑盒購自上海長島診斷試劑有限公司。

1.3.2 癌組織及癌旁正常組織CD68+TAMs、CD166+CSCs表達檢測：免疫組化染色采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC法)。取手術(shù)切除癌組織及配對的癌旁正常組織標本(距癌組織邊緣>5 cm)，體積分數(shù)10%甲醛固定12 h，石蠟包埋，4 μm厚切片，60℃下烤片60 min，常規(guī)脫蠟水化。3%雙氧水覆蓋玻片，避光、室溫下封閉10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，雙蒸水沖洗3次。玻片完全浸潤于檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值6.0)中，微波爐抗原修復(fù)15 min，室溫冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗10 min。免疫組化筆圈出組織固定范圍，用山羊血清封閉液覆蓋玻片，室溫封閉孵育20 min后，滴加一抗，冰箱4℃孵育過夜。PBS沖洗15 min，滴加二抗，SABC試劑覆蓋切片，37℃下封閉20 min，PBS沖洗10 min。新鮮DAB適度染色，蘇木精復(fù)染30 min，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。用已知陽性片作對照，用PBS代替一抗作陰性對照。每張切片在光鏡200倍鏡下隨機觀察3個具有代表性的視野拍攝照片。CD68染色定位于TAMs的胞膜或胞漿，CD166染色定位于CSCs的胞膜或胞漿。根據(jù)染色強度和(或)陽性細胞所占比例，采用半定量計分法判定免疫組化染色結(jié)果。染色程度：陰性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性范圍：<5%為0分，5%～24%為1分，25%～50%為2分，51%～74%為3分，≥75%為4分。將上述2項評分相加作為最終評分結(jié)果：0分為陰性，<4分為低表達，≥4分為高表達。

1.3.3 隨訪：通過電話和復(fù)診病歷進行隨訪，計算患者的總生存期(overall survival，OS)。OS定義為從手術(shù)次日開始，至因任何原因引起死亡的時間。隨訪時間為3～72個月，中位隨訪時間為36個月，截止時間為2020年1月31日或死亡。連續(xù)2次無法聯(lián)系定義為失訪，失訪率為9.5%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)，Kaplan-Meier法及Log-Rank檢驗進行生存預(yù)后分析，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC患者癌組織與癌旁正常組織CD68+TAMs、CD166+CSCs陽性表達率比較 CRC患者癌組織CD68+TAMs[49.3%(73/148)]、CD166+CSCs[52.7%(78/148)]陽性表達率均高于癌旁正常組織[9.5%(14/148)、6.8%(10/148)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為56.667、74.776，P<0.05)。見圖1。

2.2 CD68+TAMs、CD166+CSCs表達與結(jié)直腸癌患者

CD68+TAMs在癌旁正常組織中的表達 CD68+TAMs在癌組織中的表達 CD166+CSCs在癌旁正常組織中的表達 CD166+CSCs在癌組織中的表達

臨床病理特征的關(guān)系 CD68+TAMs、CD166+CSCs表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及分化程度密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者各分組與臨床病理特征之間的關(guān)系 例

2.3 結(jié)直腸癌組織中CD68+TAMs和CD166+CSCs表達水平的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織中CD68+TAMs和CD166+CSCs的表達水平呈明顯正相關(guān)(r=0.777，P<0.01)。見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中CD68+TAMs與CD166+CSCs表達水平的相關(guān)性 例

2.4 CD68+TAMs、CD166+CSCs表達分組與患者生存期之間的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，CD68+TAMs、CD166+CSCs無高表達組(n=88)的5年生存率為69.0%，單一高表達組(n=21)的5年生存率為49.4%，均高表達組(n=39)的5年生存率為20.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank χ2=26.743，P<0.05)。見圖2。

圖2 CD68+TAMs和CD166+CSCs表達分組與患者生存期的關(guān)系

2.5 預(yù)后影響因素 單因素分析顯示，腫瘤大小(HR=2.404，95%CI=1.261～4.585，P=0.008)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=2.432，95%CI=1.353～4.373，P=0.003)、TNM分期(HR=3.553，95%CI=1.927～6.550，P<0.001)、CD68+TAMs和CD166+CSCs聯(lián)合分組(HR=3.999，95%CI=2.024～7.900，P<0.001)與CRC患者的OS有關(guān)，而性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度與患者的OS無關(guān)(P>0.05)。把單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入Cox多因素回歸模型進行危險因素分析，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=0.340，95%CI=0.125～0.925，P=0.035)、TNM分期(HR=4.496，95%CI=1.694～11.932，P=0.003)、CD68+TAMs和CD166+CSCs聯(lián)合分組(HR=2.856，95%CI=1.364～5.983，P=0.005)是影響OS的獨立危險因素，而腫瘤大小(HR=1.542，95%CI=0.666～3.572，P=0.312)并非影響OS的獨立危險因素。見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者的預(yù)后影響因素分析

3 討論

CRC的發(fā)生發(fā)展是多因素、多環(huán)節(jié)、多階段參與的復(fù)雜過程，在此過程中，CRC細胞及其周圍環(huán)境構(gòu)成了特異性的TME。CRC細胞與TME中的多種成分相互串擾、協(xié)同作用，從而促進其發(fā)生發(fā)展[6]。有關(guān)TME的研究已成為當前抗癌研究領(lǐng)域的熱點之一[7]。TAMs和CSCs作為TME中的關(guān)鍵作用者，已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤的進展中起著至關(guān)重要的作用[2,8]。

不同的微環(huán)境可能導(dǎo)致兩種不同極化的TAMs：經(jīng)典激活型(M1型)和替代激活型(M2型)。M1型TAMs被認為是促進炎性反應(yīng)和抗腫瘤活性，而M2型TAMs則是扮演著抑制炎性反應(yīng)和促進腫瘤惡性生長的負面角色，二者可以相互轉(zhuǎn)化[9]。既往研究表明，TME中TAMs的表型和功能與M2型相似，通過促進腫瘤血管和淋巴管的生成，抑制T細胞功能，增強腫瘤細胞化療藥物抗性等來發(fā)揮促癌效應(yīng)[10-12]。Kim等[13]通過對584例CRC組織的免疫組化結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中高密度的CD68+TAMs與CRC患者TNM分期晚及預(yù)后差顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CRC癌組織中CD68+TAMs表達陽性率明顯高于癌旁正常組織，提示CD68+TAMs表達上調(diào)與CRC的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)CD68+TAMs的表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度等顯著相關(guān)，而這些臨床病理特征通常代表腫瘤有著更強的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，提示CD68+TAMs高表達的CRC患者預(yù)后不良。

CSCs具有極強的致瘤潛力，在體內(nèi)以較低的數(shù)量就可以形成腫瘤，且對化療藥不敏感，被認為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[14]。張鈞書等[15]研究發(fā)現(xiàn)CD166 陽性表達與腫瘤局部進展和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，是判斷預(yù)后不良的標志，并且CD166 陽性的腫瘤細胞可能具有肝轉(zhuǎn)移潛能。一項薈萃分析研究顯示，CD166+CSCs在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯高于結(jié)腸腺瘤組織和正常結(jié)腸黏膜組織，而且其表達與預(yù)后不良相關(guān)，有望成為Ⅱ期CRC患者生存的預(yù)測性生物標志物[16]。在本研究中，CRC癌組織中CD166+CSCs表達陽性率明顯高于癌旁正常組織，且表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度等侵襲性腫瘤表型相關(guān)，提示CD166+CSCs表達上調(diào)后腫瘤的惡性程度變高，易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后差。

研究表明，TAMs通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)誘導(dǎo)上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，使肝癌細胞的CSCs標志物表達上調(diào)，成瘤能力增強[17]。在肝內(nèi)膽管癌中，CSCs可以通過分泌骨膜素等募集大量的TAMs在腫瘤部位浸潤并且維持TAMs的促腫瘤表型[18]。本研究分析了CRC癌組織中CD68+TAMs與CD166+CSCs表達水平的相關(guān)性并對其進行了聯(lián)合分組。結(jié)果顯示，二者表達水平呈明顯正相關(guān)，且隨著二者表達率的增加，CRC患者的5年生存率明顯降低。此外，多因素回歸分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、CD68+TAMs與CD166+CSC聯(lián)合分組是CRC患者預(yù)后不良的獨立危險因素。上述研究結(jié)果進一步表明，CD68+TAMs和CD166+CSCs有望作為CRC臨床診療及預(yù)后情況判斷的潛在靶點，同時提示TAMs與CSCs在CRC的發(fā)生發(fā)展中相互誘導(dǎo)并起協(xié)同作用。其作用機制可能在于TAMs能分泌某類細胞因子使CRC細胞獲得干性，和(或)CSCs可以產(chǎn)生某類趨化因子以募集更多的TAMs至TME，從而促進CRC細胞生長。

綜上所述，CD68+TAMs和CD166+CSCs在CRC的發(fā)生發(fā)展中可能起協(xié)同促進作用，二者的同時高表達更能提示CRC患者預(yù)后不良。聯(lián)合檢測二者可進一步提高對CRC患者預(yù)后的判斷價值，并指導(dǎo)臨床進行更為精準的治療。