下調TP53INP1基于PI3K/AKT/mTOR信號通路對宮頸癌細胞凋亡、侵襲、遷移的影響

龍燕 李卉 吳玲艷

宮頸癌為臨床常見惡性腫瘤，可對女性的生命健康造成威脅，宮頸癌臨床發病率逐年上升，一般性生活紊亂、早婚、早育及多產的女性患病率極高，鑒別疾病時可通過各項癥狀及體征與子宮的其他腫瘤等進行鑒別[1,2]。臨床對于宮頸癌的診斷與治療尚未發現有效的治療手段，部分患者預后身體狀況較差。近年來研究表明，對TP53INP1基因進行調控可用于宮頸癌的診斷與治療，且TP53INP1在機體多種生理疾病中具有重要作用，可參與多種惡性腫瘤的發生與發展[3,4]。臨床關于TP53INP1與宮頸癌的關系研究較少，僅有李明如等[5]研究顯示TP53INP1高表達于宮頸癌患者。基于此，在本文中分析下調TP53INP1基于PI3K/AKT/mTOR信號通路對宮頸癌細胞凋亡、侵襲、遷移的影響，為宮頸癌的診斷與治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 宮頸癌細胞株購于蘇州瑞諾德生物科技有限公司；PI3K、AKT、mTOR抗體購于武漢益普生物科技有限公司；PCR擴增儀以及Western blot電泳儀均購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床標本收集與細胞培養：將宮頸癌細胞放置在RPMI 1640培養基于37℃ 5% CO2飽和濕度環境下培養。

1.2.2 細胞轉染與分組：應用Lipofectamine2000試劑將TP53INP1 inhibitor及TP53INP1 mimics轉染宮頸癌細胞，分為上調組和下調組，轉染24 h后將細胞正常培養，并于-80℃保存，供后續實驗使用，而對照組不做任何特殊處理。

1.2.3 TP53INP1檢測：采用實時熒光定量PCR測定TP53INP1表達量，利用PCR試劑盒合成cDNA。逆轉錄：14 μl模板RNA、2 μl Enzyme mix，4 μl 5×RT緩沖液，補至20 μl，在PCR檢測儀上42℃ 1 h、95℃ 5 min，之后將所合成的cDNA放置于溫度為-20℃環境下進行保存。反應體系：8 μl cDNA模板、10 μl SYBRP Green mix、2 μl PCR Primer mix。反應條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s；60℃ 1 min；40個循環。以U6為內參，以2-ΔΔCt表示相對表達量，實驗重復3次。TP53INP1上游引物：5’-TCACGGTCGAGTTTTCCCAG-3’，下游引物：5’-GGAAGGGCACAAATCCAGCT-3’；U6引物序列：上游：5’-GTGGCAAACCATGTCGTAC，下游：TGGAAGCACCACAACTAGA-3’。

1.2.4 細胞凋亡能力：采用流式細胞儀檢測細胞凋亡能力以及周期情況，將細胞放于室溫中孵育，30 min后加入溶血劑，待完全溶血后行離心處理，10 000×g離心5 min，將上清液棄除后，使用洗滌液洗滌，之后將150 μl固定劑加入至各管中，使用0.6 ml PBS混合均勻制備為懸液，將細胞濃度調整為1×105～1×106/ml，完成后使用流式細胞儀檢測(美國Becton Dickinso公司)細胞比值。

1.2.5 細胞遷移檢測：采用細胞劃痕實驗對細胞遷移能力進行檢測，使用PBS清洗細胞3次，并劃下細胞，均勻劃出橫線，保證在每個細胞單層中創建一個劃痕，在細胞遷移的過程中進行捕捉圖像，并確定細胞遷移的變化。

1.2.6 細胞侵襲檢測：采用Transwell小室實驗對細胞細胞侵襲能力進行檢測，3組選出3個復孔，對細胞進行胰酶消化1～2次，接著采用重懸細胞并將細胞密度進行調整，并加入150 μl細胞懸液進行培養，最后使用乙醇固定5 min，進行溶液染色，顯微鏡對細胞進行計數，并拍照進行記錄，觀察細胞侵襲情況。

1.2.7 PI3K/AKT/mTOR：采用Western blot法檢測PI3K/AKT/mTOR通路中相關蛋白表達量，將細胞組織接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進行處理，采用BCA法檢測其濃度，后制作電泳樣品，對50 μg進行SDS-PAGE電泳處理，其蛋白轉至PVDF膜后加入脫脂奶粉，封閉1 h后，加入一抗(1∶1 000)，4℃下孵育過夜，洗膜5 min/次，共3次，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜5 min/次，共3次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內參蛋白為GAPDH。

2 結果

2.1 3組TP53INP1表達情況比較 與對照組比較，上調組TP53INP1升高，下調組TP53INP1降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與上調組比較，下調組TP53INP1降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組TP53INP1表達情況比較

2.2 3組細胞凋亡情況比較 與對照組比較，上調組12 h、24 h、72 h細胞凋亡率降低，下調組12 h、24 h、72 h細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與上調組比較，下調組12 h、24 h、72 h細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組細胞凋亡情況比較

2.3 3組細胞侵襲、遷移能力比較 與對照組比較，上調組細胞侵襲率、遷移率升高，下調組細胞侵襲率、遷移率降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與上調組比較，下調組細胞侵襲率、遷移率降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2，表3。

對照組 上調組 下調組

對照組 上調組 下調組

表3 3組細胞侵襲、遷移能力比較

2.4 PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達量比較 與對照組比較，上調組PI3K、AKT、mTOR升高，下調組PI3K、AKT、mTOR降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與上調組比較，下調組PI3K、AKT、mTOR降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達量比較

圖3 3組細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白WB圖；A對照組；B上調組；C下調組

3 討論

宮頸癌在婦科惡性腫瘤中較為常見，具有較高發病率與死亡率，并威脅患者生命安全。宮頸癌的發生與多種疾病因素相關，但目前尚未明確其發病機制，且臨床尚未出現理想的治療手段。研究表明，宮頸癌細胞的遠處轉移可促進宮頸癌的發生與發展，故尋找診斷與治療宮頸癌的靶點對于改善患者預后具有重要的意義[6]。

已有的研究表明，腫瘤蛋白P53誘導性核蛋白1(TP53INP1)位于8號染色體，為蛋白質編碼基因，在急性淋球菌性前列腺炎等疾病中均有表達[7,8]。隨著臨床上對于TP53INP1的研究發現，TP53INP1可對癌細胞的增殖、遷移、侵襲造成較大影響，有研究證明，TP53INP1高表達于乳腺癌患者，且TP53INP1表達水平可影響胰腺癌、卵巢癌的發生與發展[9]。羅擎英等[10]研究發現，下調TP53INP1表達可以抑制癌細胞的增殖，促進宮頸癌細胞的凋亡，并抑制癌細胞的侵襲與遷移。王輝等[11]研究認為，TP53INP1在宮頸癌組織中呈現高表達，且TP53INP1基因異常表達可促進宮頸癌細胞從正常癌變到高低分化的發展，隨著TP53INP1表達水平的升高，患者生存期呈縮短趨勢。基于上述研究，本文下調TP53INP1在宮頸癌細胞中表達水平，分析TP53INP1表達降低對宮頸癌細胞遷移、侵襲及增殖率的影響；結果顯示，TP53INP1表達降低可增加宮頸癌細胞的凋亡率，使宮頸癌細胞的增殖、遷移行為受到抑制，證明降低TP53INP1在宮頸癌細胞的中表達可對癌細胞的生物學行為造成影響，促進癌細胞凋亡，表明宮頸癌的發生與發展與TP53INP1表達具有一定相關性。

本研究結果顯示，下調TP53INP1可抑制宮頸癌細胞遷移、侵襲，促進凋亡，提示下調TP53INP1可抑制宮頸癌轉移。Park等[12-14]研究顯示，宮頸癌細胞的發生與發展與PI3K/AKT/mTOR信號通路相關，且PI3K/AKT/mTOR信號通路在宮頸癌細胞的侵襲、轉移中具有重要作用，可使細胞的正常增殖保持穩定，并維持細胞的正常功能；此外，細胞癌變后AKT表達受到P13K的抑制，可抑制癌細胞增殖、遷移，對疾病的惡化進行抑制。細胞凋亡可以分為病理性死亡以及生理性死亡，細胞壞死為細胞死亡的一種方式，且細胞凋亡中細胞發生紊亂可影響疾病的發生與發展[15-17]。PI3K/AKT/mTOR信號通路在臨床研究中備受關注，與腫瘤細胞的糖代謝關系較為密切。

研究顯示，AKT被激活后可促進癌細胞的增殖與遷移，且PI3K可負向調控AKT的產生[18]；相關研究顯示，AKT又稱蛋白激酶B，是一種原癌基因，在細胞的凋亡以及存活中有著重要的作用，AKT為經典信號途徑，被活化成為p-AKT，使腫瘤細胞的生長加快，并腫瘤細胞的凋亡進行抑制[19-21]。本文結果顯示，調控PI3K/AKT/mTOR信號通路可下調TP53INP1表達水平，抑制宮頸癌細胞遷移、侵襲，并促進其凋亡，且下調TP53INP1后PI3K、AKT、mTOR表達降低，說明經下調TP53INP1，可使PI3K/AKT/mTOR信號通路活性受到抑制。

綜上所述，本文研究發現宮頸癌中TP53INP1呈現高表達，下調TP53INP1可抑制宮頸癌細胞遷移、侵襲，促進凋亡，其機制可能與調控PI3K/AKT/mTOR信號通路相關，經調控PI3K、AKT、mTOR表達抑制細胞增殖、遷移，促進凋亡。