葫蘆籽的超聲波輔助三相分配提取工藝

黃正虹，汪祖華*

1.貴州中煙工業有限責任公司技術中心（貴陽 550000）；2.貴州中醫藥大學藥學院（貴陽 550000）

葫蘆是葫蘆科的一種常見草本植物，被廣泛種植于亞洲、歐洲和南美洲。葫蘆籽含有豐富的不飽和脂肪酸和生物活性物質的油[1]、蛋白質、植物甾醇、維生素和多糖。研究表明，葫蘆籽油具有極好的保健功效；葫蘆籽油提取的蛋白質具有抑制細菌生長、抑制炎癥和降低血糖等生理功能；從葫蘆果肉中提取的多糖具有增加血清胰島素水平、降低血糖水平和改善葡萄糖耐量的能力，可用作新型抗胰島素劑[2-4]。

超聲波輔助三相分配提取（UTPP）技術是一種綠色、高效的提取方法，是將粗提取物或懸浮液與固體鹽和有機溶劑混合，同時形成三種不同的相[4]。上相是叔丁醇層，主要含有脂類、色素等非極性化合物，中間的沉淀相是蛋白質層，下面的水相是水層，其中含有一些極性化合物，如多糖。

近年來，雖然UTPP技術應用于從天然作物中提取和純化酶、脂質、蛋白質、多糖和其他物質，但是很少使用UTPP技術同時提取油、蛋白質和多糖的研究。因此，研究的目的是通過UTPP技術同時提取分離CSO、CSP和CSPS。研究考察了硫酸銨添加量、叔丁醇與漿液的比例、pH、超聲功率、輻射時間和占空比對CSO、CSP和CSPS提取率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

葫蘆籽于中國內蒙古自治區巴彥淖爾市杭錦后旗市場購買。將干凈的葫蘆籽放入DZF-6250真空干燥器（上海友誼儀器有限公司）中，在60 ℃和25 kPa下干燥24 h，達到2 g/100 g的含水量。研磨后，葫蘆籽通過0.425 mm篩，密封在密封袋中，儲存在4 ℃直到提取。正己烷[國藥試劑公司（上海市），色譜純]。其他試劑（包括叔丁醇、硫酸銨、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、苯酚、硫酸）均購自國藥試劑公司（上海市），分析純。

1.2 葫蘆籽組分分析

參照AOCS[5]的標準方法分析了葫蘆籽的水分、油和蛋白質含量，參照AOAC[6]的標準方法分析了灰分含量。葫蘆籽粉的含油量為46.17±0.11 g/100 g，蛋白質含量為30.25±0.23 g/100 g，初始含水量為9.43±0.11 g/100 g，總灰分含量為5.54±0.16 g/100 g。

1.3 UTPP提取CSO，CSP，CSPS工藝

葫蘆籽漿是通過將葫蘆籽粉與蒸餾水以1∶20（g/mL）混合來制備的。在室溫下，將一定比例的(NH4)2SO4（10～50 g/100 mL）添加到葫蘆籽混合物中，并輕輕攪拌使其充分混合。使用0.1 mol/L鹽酸溶液和0.1 mol/L NaOH溶液將混合物的pH調節至3～7。然后，按體積比（叔丁醇/漿液=0.5∶1.0～2.5∶1.0）加入叔丁醇。

使用20 kHz頻率的鈦超聲波探頭對混合物進行超聲處理，該探頭浸入樣品溶液中，距底部1.5 cm的深度。在脈沖模式下，混合物處理一定時間（5～25 min），同時保持一定的超聲波功率（30～150 W）和一定的占空比（20%～100%）。為了避免定位效應，使用圓底玻璃反應器。用冰浴冷卻系統，使所有樣品的溫度保持在25 ℃以下。超聲處理后，將混合物以7 600×g離心20 min，形成界限分明的三相。對上層溶劑層進行負壓蒸發以回收叔丁醇，并將獲得的CSO樣品儲存在4 ℃下。CSO提取率按式（1）計算。

CSO提取率=葫蘆籽提取物中油脂的含量（g/100 g）/所用的葫蘆籽顆粒原料中油脂的含量（g/100 g）×100% （1）

中間層主要由沉淀的CSP和脫脂葫蘆籽組成，并記錄中間相的體積。將中間層的沉淀物溶解在pH 8.0的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液中，在4 ℃放置超過12 h，并在蒸餾水中透析，然后將上清液冷凍干燥以獲得CSP。獲得的CSP儲存在4 ℃下，以供進一步研究。牛血清蛋白標準曲線由考馬斯亮藍比色法制備。CSP提取率按式（2）計算。

CSP提取率=葫蘆籽提取物中蛋白的含量（g/100 g）/所用的葫蘆籽顆粒原料中蛋白的含量（g/100 g）×100% （2）

下層水相主要由CSPS和(NH4)2SO4組成。首先記錄所獲得的下層溶液的體積，用蒸餾水透析并冷凍干燥以獲得CSPS。CSPS儲存在4 ℃下，供后續研究使用。用苯酚-硫酸法（以d-葡萄糖為標準）測定樣品在波長490 nm處的吸光度，計算出樣品中CSPS的含量，進而計算出葫蘆籽多糖的提取率。CSPS提取率按式（3）計算。

CSPS提取率=葫蘆籽提取物中多糖的含量（g/100 g）/所用的葫蘆籽顆粒原料中多糖的含量（g/100 g）×100% （3）

1.4 響應面法的優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇響應面法中的Box-Behnken試驗設計進行參數優化，以獲得最佳響應值。以超聲功率（A）、輻照時間（B）和占空比（C）為自變量，以CSO提取率（R1）、CSP提取率（R2）和CSPS提取率（R3）為響應值，設計了三因素三水平的響應面試驗，設計概要見表1。通過軟件（Design Expert 8.0.6，USA）分析二次多項式模型的系數。使用ANOVA進行統計分析以獲得UTPP的最佳條件。

表1 Box-Behnken試驗設計因素和水平

2 試驗結果與討論

2.1 添加(NH4)2SO4的影響

在TPP系統中，(NH4)2SO4是最常用的鹽析試劑，因為它便宜，對蛋白質溫和，并且具有高溶解度[10]。如圖1（A）所示，隨著(NH4)2SO4的添加量從10 g/100 mL增加到50 g/100 mL，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率均呈現先增加后減少的趨勢，這是因為鹽析效應隨著體系中鹽濃度的增加而變得更強。(NH4)2SO4的最佳濃度將使蛋白質絮凝并將其分離到相間，最大限度地釋放與蛋白質結合的脂質，從而最大限度地溶解叔丁醇相中的脂質[7]。因此，當(NH4)2SO4濃度為30 g/100 mL時，CSO提取率和CSP提取率最高，分別為38.99%和14.27%。然而，在較低的(NH4)2SO4添加量（20 g/100 mL）下，鹽的增溶作用可以促進CSPS在下相中的有效分配。因此，當(NH4)2SO4的加入量為20 g/100 mL時，CSPS提取率最高，為2.05%。

圖1 UTPP法測試參數對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影響

(NH4)2SO4濃度過高導致蛋白質不可逆變性，不利于油體中蛋白質和脂類的分離，導致CSO提取率和CSP提取率下降。同時，隨著(NH4)2SO4添加量的增加，CSPS提取率也降低，這是因為隨著鹽離子濃度的增加，鹽離子結合了更多的水分子，導致與水分子之間形成的氫鍵網絡減弱，進而影響多糖的提取[7]。

(NH4)2SO4濃度為30 g/100 mL時，CSO提取率和CSP提取率最高，而(NH4)2SO4濃度為20 g/100 mL和30 g/100 mL時，CSPS提取率之間的差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇濃度為30 g/100 mL的(NH4)2SO4進行進一步研究。

2.2 叔丁醇與漿液比例的影響

叔丁醇是TPP中常見的溶劑，具有良好的水溶性，可以有效分離蛋白質、色素、脂質等各種生物分。如圖1（B）所示，當叔丁醇與漿液的體積比從0.5∶1.0（mL/mL）增加到1.0∶1.0（mL/mL）時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率逐漸增加。叔丁醇濃度的增加促使沉淀的蛋白質漂浮在下層水相（含水的鹽層）之上，這促進了蛋白質與脂質和多糖的分離，同時促進了CSO在叔丁醇中的溶解。因此，當叔丁醇與漿液的體積比為1.0∶1.0（mL/mL）時，CSO、CSP和CSPS的提取率最高，分別為39.74%，14.17%和1.94%。

當叔丁醇與漿液的體積比繼續增加到2.5∶1.0（mL/mL）時，CSO提取率沒有顯著變化，而CSP提取率和CSPS提取率均下降。這是因為大量叔丁醇導致蛋白質變性，這不利于蛋白質沉降到相間[8]。隨著叔丁醇含量的增加，它與硫酸根離子競爭水分子，因此影響CSPS在下相中的溶解。結果表明，在漿液和叔丁醇的比例為1∶1時，可可脂替代品的提取率最高[9]。當叔丁醇與漿液的體積比為1.0∶1.0（mL/mL）時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率達到最大值，因此選擇叔丁醇與漿液的體積比1.0∶1.0（mL/mL）進行進一步研究。

2.3 pH的影響

UTPP的分離效率與pH的變化高度相關。由于pH的變化會影響大分子之間的靜電相互作用，因此UTPP系統中蛋白質和多糖的分配會隨著pH的變化而變化。在圖1（C）中，隨著pH從3增加到7，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率呈現出先增加后減少的趨勢。在pH 5時，最大的CSO提取率和CSP提取率分別為38.99%和14.17%，而在pH 6時最大的CSPS提取率為2.06%。一些研究結果顯示，CSP在pH約為5.0時溶解度最低。當體系pH約為5時，CSP的凈電荷為零，蛋白質的沉淀量最大，有利于油體中油和蛋白質的分離，進而促進CSO在叔丁醇中的溶解。因此，CSO提取率和CSP提取率在pH 5時達到最大值。

隨著pH的增加，蛋白質表面帶負電荷，這將增加蛋白質在下層相中的溶解度，對油和蛋白質的提取不利。因此，隨著pH繼續增加，CSO提取率和CSP提取率逐漸降低。pH的變化也會影響與多糖結合的糖蛋白的分離，從而影響CSPS提取率。CSO提取率和CSP提取率在pH 5時達到最大值，而在pH 5和pH 6時對CSPS提取率的影響的可變性不顯著（P＞0.05）。考慮到pH對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影響，選擇pH 5作為研究的下一步。

2.4 超聲波功率的影響

超聲波功率對提取效率有積極的貢獻。超聲功率的增加放大了空化效應和機械剪切，促進了傳質，有利于快速萃取。如圖1（D）所示，隨著超聲功率從30 W增加到150 W，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率均呈現先增加后降低的趨勢，當超聲功率為120 W時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率達到最高值，分別為38.99%，14.17%和1.94%，這是由超聲波產生的聲空化現象引起的。在超聲波處理過程中，瞬態氣泡在幾個聲學周期內迅速形成，當它們在介質中達到臨界尺寸時會強烈破裂，這種現象增加了空化區域的局部壓力，并在液體周圍產生高剪切和湍流，這加速了傳質過程[7,9-10]，因此有利于CSO、CSP和CSPS的提取。然而，當超聲功率過高時，空化氣泡劇烈破裂，導致空化效應的中斷，因此CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率減少。CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率在120 W的超聲功率下達到最大值。因此，選擇120 W的超聲功率用于進一步研究。

2.5 輻照時間的影響

研究了超聲處理時間對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影響，結果顯示在圖1（E）中。如圖1（E）所示，當超聲處理時間為15 min時，CSP提取率達到最大值2.01%，而CSO提取率和CSPS提取率在超聲處理時間為20 min時達到最高值，分別為38.99%和14.17%。超聲波輔助提取可以在短時間內實現物質的有效提取，這是由于超聲的瞬時空化效應破壞了生物膜和細胞壁，促進了溶劑和固體之間的有效接觸，并使溶劑滲透到細胞中，從而加速了TPP的分離效率。因此，它有利于充分提取CSO，CSP和CSPS，并縮短提取時間[7,10]。CSO提取率和CSP提取率在照射時間為20 min時達到最大值。15和20 min的照射時間對細胞毒性的影響差異不顯著（P＞0.05）。結合輻照時間對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影響，選擇20 min的輻照時間用于進一步研究。

2.6 占空比的影響

考慮到換能器的腐蝕和由此產生的過熱，研究人員不建議連續使用超聲波。因此，為該系統選擇超聲波處理的脈沖模式，并表示為占空比。通過改變超聲波開啟和關閉時間來改變占空比。如圖1（F）所示，當占空比從20%增加到100%時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率都顯示出先增加后減少的趨勢。占空比為60%時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率值最高，分別為38.99%，14.17%和1.94%。超聲處理產生的空化氣泡的破裂會在周圍流體中引起高溫、高壓和微射流的瞬態。當占空比為20%（即脈沖間隔延長）時，微射流的這種狀態迅速消失。因此，較低的占空比不利于CSO、CSP和CSPS的提取。當占空比增加時，系統中的固體和液體顆粒在超聲處理下振蕩并獲得更快的速度，導致可溶性物質從原料快速擴散到溶劑中，從而促進CSO、CSP和CSPS的提取[8]。

超聲作用引起的空泡潰滅可產生高達5 000 K的局部溫度和高達1 000 MPa的壓力。當占空比達到100%時，連續超聲作用產生的熱量難以迅速擴散，導致局部溫度過高，不利于CSO、CSP和CSPS的提取。此外，使用脈沖超聲治療比連續超聲治療更節能。為了優化UTPP同時提取CSO、CSP和CSPS的超聲處理參數，對超聲功率、輻射時間和占空比三個自變量進行了響應面優化試驗。其他操作條件：(NH4)2SO4的加入量為30 g/100 mL，叔丁醇與漿液的比例為1.0∶1.0（mL/mL），pH為5。

2.7 響應面法優化CSO、CSP和CSPS提取

2.7.1 干擾分析

將獨立變量組合到響應曲線中，利用擾動圖研究了這3個變量對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的擾動影響。試驗自變量對響應值的影響與曲線的斜率密切相關。斜率較大的響應曲線意味著相應的試驗因子對響應值敏感，而斜率較小的曲線表明響應值對該因子不敏感。在繪制過程中，通過改變測試范圍內的單個因素并固定其他因素來檢查響應值與參考點的偏差。圖2顯示占空比和超聲功率比照射時間對CSO提取率更敏感。圖2中的曲線表明，照射時間和占空比對CSP提取率更敏感，對于CSPS提取率，照射時間最敏感，占空比不太敏感。

圖2 測試參數對擾動的影響

2.7.2 響應面模型分析

采用BBD法對超聲功率、輻射時間和占空比參數進行優化，得到最佳提取工藝條件。17次運行的試驗數據和RSM模型的預測數據如表2所示，二次模型的ANOVA值如表3所示。如表3所示，“缺乏擬合P值”不顯著（P＞0.05），回歸分析顯著，F值分別為84.12，88.06和30.25，表明三個因素與響應值之間存在顯著的非線性關系。模型的R平方值分別為0.990 9，0.991 2和0.975 4，adj的R平方值分別為0.979 2，0.980 0和0.943 7，充分證明了模型與試驗擬合良好。“Adeq精度”值分別為28.958，26.862和14.229，也表明該模型是理想的。所有三個模型的變異系數（C.V.）都小于5%，這代表了模型的良好再現性。

表2 RSM模型的測試數據和預測數據比較

表4 回歸方程方差分析

2.7.3 UTPP法提取參數的優化

基于響應面法建立的數學模型，優化的試驗條件為超聲功率117.57 W，輻射時間19.75 min，占空比62.37%。在最佳條件下，預測值分別為39.85%，14.32%和1.99%。結合實際操作，將超聲功率、輻照時間和占空比分別調整為118 W、20 min和60%。為了驗證優化結果的可靠性，在調整后的條件下進行3次試驗驗證，得到的CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率分別為39.79%±1.54%，14.30%±0.37%和1.97%±0.13%。驗證試驗結果與預測值高度一致，表明該模型能有效預測試驗結果。

3 結論

研究了用UTPP同時提取和分離葫蘆籽油、蛋白質和多糖的效果。通過單因素試驗和響應面法優化了硫酸銨添加量、叔丁醇與漿液的比例、pH、超聲功率、輻射時間和占空比等參數，以實現CSO、CSP和CSPS的高效提取。當(NH4)2SO4加入量為30 g/100 mL，叔丁醇與漿料的比例為1.0∶1.0（mL/mL），pH為5，超聲功率為118 W，輻射時間為20 min，占空比為60%時，獲得最高的CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率。工藝分析和優化結果表明，占空比和超聲功率對CSPS提取率的影響比輻照時間更敏感，占空比和輻照時間對CSP提取率的影響更敏感，輻照時間對CSPS提取率的影響最敏感。同時，試驗結果與預測值吻合較好，表明該模型可用于指導實驗設計。與TPP方法相比，UTPP方法提取時間縮短，UTPP方法提取的CSO質量較好。天然植物油一般具有抑制刺激，醇和煙香的作用；多糖具有改善口感，增加豐滿度的作用。利用自主調香技術對葫蘆籽油和葫蘆籽多糖的香味特征進行了修飾及優化，進一步提升了葫蘆籽油和葫蘆籽多糖的品質和作為香精在卷煙中的實用性。