海參肽酸奶工藝優化及抗氧化性研究

肖彥春，田曉玲，郝長紅，劉巍巍，龐然

遼寧農業職業技術學院食品藥品學院（營口 115009）

海參素有“海中人參”之稱，其作為高效營養滋補品已被熟知。海參肽是以鮮活海參為原料，經蛋白酶水解，分離純化后得到以小分子肽為主，多種功效成分共存的蛋白質水解產物[1]。其具有良好的溶解性、穩定性，低黏度，易消化吸收，生物效價高，無抗原性，食用安全，降血壓，預防心腦血管疾病，抗疲勞，增強體力，提高免疫力，抗腫瘤，抗氧化，延緩衰老等特點[2-4]。市場上有將海參肽添加到日常食品中，如海參肽糖果、海參肽酒、海參肽酵素、海參肽固體飲料等產品[5-6]，將海參這種傳統酒席宴上的佳肴珍品制作成日常生活中營養價值更高、食用更方便的高級優質食品。而將海參肽應用到發酵乳產品中，在國內報道較少。因此，此文以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發酵劑，通過單因素試驗和正交試驗探究海參肽酸奶的最佳工藝配方，并對其抗氧化性進行評價，旨在豐富酸奶產品類型，為海參肽開發利用提供一定技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及其他添加材料

乳酸菌種YO-MIX 900 LYO 50 DCU[嗜熱鏈球菌、保加利亞亞種，丹尼斯克（中國）有限公司]；海參肽（湖北瑞邦生物科技有限公司）；蔗糖（廣西糖業集團西江制糖有限公司）。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；鐵氰化鉀（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司）；三氯乙酸、三氯化鐵（分析純，茂名市雄大化工有限公司）；DPPH（含量≥97.0%，福州飛凈生物科技）。

1.1.3 儀器與設備

電子天平（JY20002，上海舜宇恒平）；恒溫培養箱（ZHP-250，上海三發）；高壓均質機（GJJ-0.06/70，上海諾尼）；冰箱（BCD-236WDGL，海爾）；高壓蒸汽滅菌鍋（BKQP-12，山東博科）；離心機（h1850，湘儀）；分光光度計（752，舜宇恒平）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程鮮乳、蔗糖、海參肽等→混勻調制→均質→殺菌→冷卻→接菌種→灌裝→發酵→冷藏→成品

1.2.2 操作方法

1.2.2.1 調制

選擇新鮮鮮奶，總干物質含量不得低于11.5%，其中非脂干物質不得少于8.5%，否則會影響蛋白質的凝乳作用。蔗糖、海參肽等混合后加水加熱溶解充分后添加到鮮奶中混勻調制。

1.2.2.2 均質

將牛乳升溫加熱至50～60 ℃，加入至均質機中，8～10 MPa壓力下均質。均質可防止脂肪上浮，使脂肪微?；纳瓶诟?。

1.2.2.3 殺菌

將均質后的混合乳液于90～95 ℃殺菌15 min?；虿捎酶邷厮矔r殺菌，在135～140 ℃加熱2 s，有利于營養成分的保存。

1.2.2.4 冷卻、接種、灌裝、發酵

將殺菌后的混合乳冷卻到40～45 ℃，無菌條件下接種發酵劑，混合均勻，灌裝、貼上標簽，溫度在40～43 ℃下培養6～7 h。

1.2.2.5 冷藏后熟

達到發酵時間后，立即放入冰箱，進行鈍化24 h，取出。

1.2.3 單因素試驗設計

1.2.3.1 蔗糖添加量的選擇

在菌粉添加量12 mg/L、海參肽添加量2 g/L、發酵時間6 h條件下，蔗糖添加量設定為0，20，40，60和80 g/L，研究蔗糖添加量對酸奶感官的影響。

1.2.3.2 海參肽添加量的選擇

在蔗糖添加量60 g/L、菌粉添加量12 mg/L，發酵時間6 h條件下，海參肽的添加量設定為0，1.2，2.0，2.8和4.0 g/L，研究海參肽添加量對酸奶感官的影響。

1.2.3.3 菌粉添加量的選擇

在蔗糖添加量60 g/L、海參肽添加量2 g/L、發酵時間6 h條件下，菌粉添加量設定為4，8，12，16和20 mg/L，研究菌粉添加量對酸奶感官的影響。

1.2.3.4 發酵時間的選擇

在蔗糖添加量60 g/L、菌粉添加量12 mg/L、海參肽添加量2 g/L條件下，發酵時間設定為4，5，6，7，8和9 h，研究發酵時間對酸奶感官的影響。

1.2.4 正交試驗

基于單因素試驗結果，以感官評價為考察指標，采用四因素三水平L9(34)正交試驗設計。研究蔗糖添加量（A）、菌粉添加量（B）、海參肽添加量（C）、發酵時間（D）對酸奶感官品質的影響，以確定最佳海參肽酸奶工藝。正交試驗因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平

1.3 指標測定

1.3.1 感官評定

隨機選擇有經驗品評者15人組成評定小組，按照感官評分標準表（表2）評價。取10 mL乳樣放在20 mL樣品杯中，觀察乳樣的色澤和組織狀態，聞其氣味，最后口中含乳樣，品嘗滋味。感官評定綜合評分為100分，結果取15人各自評分總分的平均值。

表2 感官評分標準

1.3.2 理化和微生物指標測定

根據GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》中的指標要求，對酸奶的蛋白質、脂肪、酸度、乳酸菌數、大腸桿菌、致病菌等分別進行測定。

1.3.3 海參肽酸奶的抗氧化活性評定

1.3.3.1 還原力測定

取1.0 mL待測樣于10 mL試管中，先后向其中加入2.5 mL pH 6.6磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴反應25 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻，3 000 r/min離心5 min。取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL，加0.5 mL 1%三氯化鐵，搖勻靜置10 min，在波長700 nm處進行比色測定吸光度[7]。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率測定

取8 mL 1.0×10-4mol/L DPPH-乙醇溶液與2 mL樣品或95%乙醇（空白對照）混合、振蕩，室溫暗處放置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液于波長517 nm處測吸光度[8]。DPPH清除率用式（1）計算。

式中：A0為空白吸光度；A1為樣品吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 蔗糖添加量對海參肽酸奶感官品質的影響

從表3中可以看出，蔗糖添加量0～60 g/L時，海參肽酸奶的感官評分逐漸增加。蔗糖含量低時，酸奶甜度不足，酸度過高，風味較差，感官評分較低；隨蔗糖添加量增加，甜度逐漸增高，蔗糖添加量60 g/L時，酸奶口感光滑細膩，組織狀態良好，酸甜適中，感官評分最高88.0分；隨著蔗糖添加量繼續增加，酸奶口味偏甜，感官評分降低，因此最佳的蔗糖添加量為60 g/L。

2.1.2 海參肽添加量對海參肽酸奶感官品質的影響

從表4可以看出，海參肽添加量0～2 g/L時，酸奶的感官評分逐漸增加，組織狀態逐漸細膩。海參肽添加量2 g/L時，黏度適中，無乳清析出，入口細膩爽滑，酸甜適中，無異味，感官評分達到最高86.7分；隨著海參肽添加量的繼續增加，感官評分逐漸下降，海參肽添加量4 g/L時，酸乳的氣味、口感都明顯降低，因此海參肽的最佳添加量為2 g/L。

表4 海參肽添加量對海參肽酸奶感官品質的影響

2.1.3 菌種添加量對海參肽酸奶感官品質的影響

從表5中可以看出，菌粉添加量較少時，酸奶組織狀態粗糙，有乳清析出，有顆粒，風味不明顯；隨菌種添加量的增加，口感逐漸提高，菌種添加量達到12 mg/L時，酸奶口感光滑細膩，組織狀態良好，酸甜適中，感官評分最高87.4分；隨著菌種添加量的增加，酸奶酸度增大，口感過酸，且有微量乳清析出。因此，最佳菌種添加量為12 mg/L。

2.1.4 發酵時間對感官評分的影響

從表6中可以看出，發酵時間4～7 h時，隨著發酵時間的增加，酸奶的組織狀態、口感等逐漸變好。發酵7 h時，風味濃郁、組織均勻細膩，口感圓潤，感官評分達到最高值86.7分。隨著發酵時間的繼續延長，酸奶味道偏酸，感官評分逐漸降低。因此最佳發酵時間為7 h。

表6 發酵時間對海參肽酸奶感官品種的影響

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，以感官評分為指標，對海參肽添加量、蔗糖添加量、菌種添加量、發酵時間4個因素進行四因素三水平正交試驗（表1）。正交試驗安排和結果見表7，極差分析可以判斷出各因素對感官品質影響的順序為B＞C＞D＞A，即菌種添加量對海參肽酸奶感官品質影響最大，其次是海參肽粉添加量、發酵時間、蔗糖添加量。根據k值最佳組合A2B3C2D3和由正交表中直接對比分析的最優組合A2B1C2D3進行驗證試驗，結果見表8，可以看出組合A2B3C2D3的感官評分為87.8分，高于組合A2B1C2D3。因此海參肽酸奶的最佳配方為海參肽添加量2 g/L、蔗糖60 g/L、菌種接種量16 mg/L、發酵時間7 h。

表7 正交試驗和結果分析

表8 最優試驗組合驗證

2.3 海參肽酸奶理化和微生物檢測結果

海參肽酸奶呈乳白色，組織均勻、無氣泡、無乳清析出，口感細膩爽滑、酸甜適中，有發酵乳固有香味。海參肽酸奶理化和微生物指標檢測結果見表9，大腸桿菌、致病菌都未檢出，均符合GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》。

表9 海參肽酸奶理化及微生物檢測結果

2.4 優化后海參肽酸奶抗氧化活性

2.4.1 還原力測定

有研究表明，不同分子量海參肽都具有顯著的還原能力[9]，因此對優化后海參肽酸奶及對照酸奶進行還原力比較，測定的樣品吸光度越大表明還原力越強。由圖1可見，對照酸奶和海參肽酸奶的吸光度均隨著樣品濃度的增加而增大，并且海參肽酸奶的吸光度明顯高于對照酸奶，質量濃度為50 mg/mL時，海參肽酸奶吸光度可達0.632。

圖1 酸奶的還原力

2.4.2 DPPH自由基清除率

比較海參肽酸奶和未添加海參肽的對照酸奶對DPPH自由基的清除率，結果如圖2所示。在相同酸奶濃度時，海參肽酸奶對DPPH自由基的清除能力遠高于對照酸奶，并隨著酸奶濃度的增加，DPPH自由基的清除率逐漸增強，質量濃度50 mg/mL時，海參肽酸奶對DPPH的清除率達58.6%。對海參肽的研究中發現其抗氧化性高于天然抗氧劑維生素C，具有較好清除自由基的作用[10]。有研究發現發酵乳中乳酸菌具有清除自由基的能力[11]，并且有報道酸奶中組氨酸、酪氨酸、賴氨酸等游離氨基酸具有抗氧化性[12]。通過海參肽的添加，進一步增強酸奶的抗氧化性，提高酸奶的附加值。

圖2 DPPH自由基清除率

3 結論

試驗以鮮牛奶、海參肽粉為原料，以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為菌種，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗對海參肽酸奶進行進一步優化，確定海參肽酸奶最佳配方：海參肽添加量2 g/L、蔗糖60 g/L、菌種接種量16 mg/L、發酵時間7 h。該配方下酸奶組織均勻，口感細膩爽滑、酸甜適中，感官評分最高為87.8分，其理化指標和微生物指標都符合GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》。海參肽酸奶的還原力及DPPH自由基清除率均高于對照酸奶，說明海參肽酸奶有效提高酸奶的抗氧化能力，提高產品的保健功能，為豐富酸奶產品類型、為海參肽開發利用提供新思路。