桃金娘多酚的響應面優化提取及抗氧化活性研究

徐艷，邱元凱，何歡，羅文敏，方廣平，駱瑋詩*

1.河源職業技術學院（河源 517000）；2.河源市吉龍翔生物科技有限公司（河源 517000）

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）又稱為稔子、山稔及烏肚子，是一種常綠花多的小灌木，屬于桃金娘科桃金娘屬植物，主要分布于中國南部，如臺灣、廣西、廣東、云南、湖南等地。桃金娘抗逆性強，常生長在貧瘠的丘陵坡地，是一種優良的藥食同源類野生植物資源。桃金娘性味甘澀平，以根、葉和果入藥，具有養血、止血、澀腸、固精之功效[1]，其果實中含有三萜類、黃酮類、鞣酸（單寧、多酚）類、多糖類及色素類化學成分[2]。國內外研究數據表明，桃金娘具有很高的抗氧化活性，每克桃金娘的DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）與28.5 μmol沒食子酸、67.2 μmol抗壞血酸（VC）[3-4]相當。桃金娘具備諸多生物活性，包括抗病毒、抗菌與抗氧化等[5-12]，體現出廣泛的應用價值，是應用開發價值較高的一類野生資源。相關研究顯示，桃金娘總酚含量很高，這決定了其果實抗氧化活性較高[13]。因此，對桃金娘多酚提取條件進行優化，以提高多酚提取量，對桃金娘抗氧化活性相關產品開發應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃金娘果實干貨（烘干后粉碎，過0.150 mm孔徑篩，即100目）。

沒食子酸對照品（含量≥98%）、無水乙醇、無水碳酸鈉、福林酚試劑、無水甲醇、DPPH、ABTS（2, 2-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、VC、草酸（均為國藥集團產品）。

1.2 主要儀器與設備

UV1700紫外-可見分光光度計（日本島津）；Mil-li-Q超純水儀（Millipore公司）；F160型粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）；FA2004B分析天平（精度0.000 1 mg，上海佑科公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

通過沒食子酸的當量（GAE）表示總多酚含量（mg GAE/g，干質量）。分別將質量濃度皆為1.0 mg/mL但體積不同的標準沒食子酸溶液移入容量瓶（50 mL）內，分別吸量1 mL稀釋液放到比色管（10 mL）內，添加5 mL去離子水，加入1 mL的福林酚顯色劑（1∶9，V/V），搖勻，添加3 mL的Na2CO3溶液（7.5%），避光靜置1 h后，進行最大吸收波長掃描[14-15]，得到的最大吸收波長為754 nm，測定待測溶液的A754nm。以橫坐標為多酚質量濃度（以沒食子酸計），縱坐標為A754nm進行標準曲線的繪制，獲得多酚標準曲線方程，見式（1）。

式中：x為多酚質量濃度（以沒食子酸計），μg/mL；y為所對應的吸光度（A754nm）。

1.3.2 單因素試驗設計

逐一考察處理溫度、料液比、提取時間、無水乙醇體積分數等單因素影響桃金娘多酚提取量狀況。提取步驟：準確稱取2.0 g相同批次的桃金娘果實粉末，設置不同料液比（1∶70～1∶120 g/mL），分別添加不同體積分數溶劑（30%～80%），在不同溫度（50～100℃）進行不同時間（0.5～3.0 h）的提取，并逐一抽濾，并收集上清液作為提取液，精準吸量1 mL提取液，稀釋至10 mL，計算不同條件下的桃金娘多酚提取率。

在單因素試驗基礎上對4個影響因素進行篩選，選出對多酚提取效果具有顯著影響的3個因子，為響應面優化試驗設計提供基礎。

1.3.3 響應面優化試驗設計

基于單因素試驗結果，數據分析所用工具為Box-Behnken，將桃金娘多酚提取量作為響應值，選取存在較顯著影響的3項因素，即提取溫度、料液比與乙醇體積分數開展響應面分析，圍繞工藝條件開展三因素三水平試驗設計，對提取桃金娘多酚的工藝進行優化。響應面試驗因素與水平設計情況如表1所示。

1.3.4 桃金娘多酚提取物體外抗氧化活性的測定

按照確定的最優提取條件提取桃金娘多酚，并對提取物進行抗氧化活性評價分析。

1.3.4.1 ABTS+·清除能力測定[15]

取多酚提取液溶液配制成不同質量濃度的溶液待測。吸取不同濃度樣品溶液2和8 mL ABTS工作液，振蕩10 s，徹底混合，經過6 min靜置，檢測A730nm，平行測定3次，ABTS+·清除能力見式（2）。

式中：A0為樣品空白吸光度：Ai為樣品吸光度；Aj為樣品本底吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測定[16]

分別取3 mL不同濃度水平的樣品液，同時添加3 mL的DPPH乙醇溶液（0.16 mmol/L），置于25 ℃水浴鍋中加熱15 min，對不同濃度水平的樣品液A517nm（Ai）進行測量。同時，測量樣品本底吸光度（Aj）與空白吸光度（A0），通過式（3）對DPPH消除率進行求解。

1.4 數據處理與統計分析

各項試驗皆進行3遍重復，試驗數據的整理繪圖借助軟件Origin 2018完成，在數值的PCA主成分分析方面，應用的軟件為past，借助軟件JMP 10.0完成響應面試驗的設計及整理繪圖工作，采取方差分析（ANOVA），差異顯著的要求為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 桃金娘果實多酚提取的單因素試驗結果

2.1.1 料液比對桃金娘多酚提取量的影響

當提取時間2 h，溫度80 ℃，乙醇體積分數50%時，考察料液比對桃金娘多酚提取量的影響，如圖1（a）所示。料液比在1∶70～1∶110（g/mL）的范圍內，提取量與乙醇添加量正相關，料液比1∶110（g/mL）時可獲得最大多酚含量22.90 mg GAE/g，繼續增加溶劑含量多酚提取量開始降低，可見此時已無多酚物質溶出。所以，在響應面優化試驗中，設定料液比1∶80～1∶120（g/mL）。

2.1.2 乙醇體積分數對桃金娘多酚提取量的影響

當提取時間2 h，溫度80 ℃，料液比1∶110（g/mL）時，考察浸提溶劑乙醇體積分數對桃金娘多酚提取量的影響，如圖1（b）所示。增加乙醇體積分數后，桃金娘多酚提取量大幅提高，乙醇體積分數40%～50%時，桃金娘多酚提取量達到最高的29.45 mg GAE/g，繼續增加溶劑體積分數，多酚提取量開始明顯降低。此外，若乙醇體積分數過高，會提高分離純化難度，同時導致資源浪費，所以，在響應面優化試驗中設定乙醇體積分數30%～70%。

2.1.3 提取時間對桃金娘多酚提取量的影響

當料液比1∶110（g/mL），乙醇體積分數40%，提取溫度80 ℃時，考察提取時間對桃金娘多酚提取量的影響，如圖1（c）所示。提取時間從0.5～1.5 h，桃金娘多酚提取量有少量提升，繼續延長提取時間，桃金娘多酚提取量基本穩定并有少許下降，在1.5 h時達到最高的30.29 mg GAE/g，僅比最低提取量提升6.92%，說明提取時間對桃金娘多酚的影響不顯著，結合節省能源的考慮，設定提取時間1 h進行后續試驗。

2.1.4 提取溫度對桃金娘多酚提取量的影響

當料液比1∶110（g/mL），乙醇體積分數40%，提取時間60 min時，考察提取溫度影響桃金娘多酚提取量狀況，如圖1（d）所示。在提取溫度提高的前提下，桃金娘多酚提取量有明顯增加，并在90 ℃時達到最大的31.19 mg GAE/g，繼續增加提取溫度，桃金娘多酚提取量開始降低，這可能是因為高溫容易引起多酚類物質的分解，因此，在響應面優化試驗中設定提取溫度60～100 ℃。

圖1 單因素試驗結果

為進一步優化最佳提取條件，采取響應面優化試驗設計從4個單因素中篩選出顯著影響的3個因素，圖1根據多酚提取量的變化明顯可以看出，4個影響因素中的提取時間屬于不顯著影響的因素，因此把乙醇體積分數、提取溫度與料液比設置為后續響應面試驗的因素，其試驗水平見表1。

2.2 提取桃金娘果實多酚的響應面優化試驗結果

2.2.1 響應模型的建立與分析

響應面試驗設計所用工具為Box-Behnken，優化同時確定多因素系統中最優測試條件，具體試驗設計詳情如表2所示，其中各模式皆安排3次平行試驗，將均值作為終值。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 響應面試驗結果分析

借助軟件JMP 10.0對表2所示各條件下試驗數據實施擬合，獲得多酚提取量對乙醇體積分數（X1）、溫度水平（X2）與料液比（X3）的RM（回歸模型）方程：多酚提取量=31.40-1.27X1-1.59X2-0.35X3+0.55X1X2+0.50X1X3-0.16X2X3-3.43X12-4.55X22-1.02。

由表3可知，RM存在高度的顯著水平（P值為0.000 7，在0.001以下），失擬項缺乏顯著性（P=0.150 4＞0.05），R2為0.982 6，Radj2為0.951 1，可見此模型試驗誤差不明顯，具良好擬合度，可以呈現響應值的變化，能通過該方程模型分析與預測乙醇浸提法進行桃金娘果實多酚提取的工藝參數?；貧w模型顯著性檢驗結果顯示，X1、X2、X12、同多酚提取量存在極顯著聯系（P＜0.01），X32同多酚提取量存在顯著聯系（P＜0.05）?；贔值，各個因素同桃金娘多酚提取量相關性程度由重至輕排序為提取溫度（X2）＞乙醇體積分數（X1）＞料液比（X3）。

兩兩因素交互效應響應面如圖2所示。各因素交互效應響應面開口皆向下，可見在各因素增大的同時，響應面值皆為提升表現，待至最大值又慢慢下降。響應面坡面愈陡峭，表示試驗因素對桃金娘果實多酚提取量影響于顯著，反之其愈平緩，試驗因素的影響則愈弱；乙醇體積分數與提取溫度兩因素間的交互效應響應面坡面最陡峭，且從表3的兩兩交互作用的顯著性檢驗數據也可得知，乙醇體積分數與提取溫度的相關性稍強于其他因素間的組合，由等高線分析發現，就影響多酚提取程度而言，提取溫度較強，料液比則較弱。

表3 多酚提取量為響應值的方差分析

圖2 以多酚提取量為指標的響應面圖

2.2.3 響應面試驗優化及驗證試驗

經JMP 10.0軟件模型分析，預測桃金娘果實多酚最佳提取工藝：乙醇體積分數45.71%、提取溫度76.30℃、料液比1∶95.78（g/mL），此時理論多酚提取量為31.715 6 mg GAE/g?；趯嶋H操作，對提取桃金娘果實內多酚的工藝做出設計：料液比1∶95（g/mL）、乙醇體積分數45%、提取溫度76 ℃，此條件下實施3次平行試驗，計算桃金娘多酚提取量，均值是32.58±0.24 mg GAE/g，結果與預測的理論相近，且高于正交試驗中各試驗的提取量，表明模型擬合良好，最佳工藝合理，參數準確可靠。

2.3 桃金娘果實多酚的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS+·活性

試驗結果顯示桃金娘果實多酚具有很高的ABTS+·清除能力，與抗壞血酸的清除效果接近（見圖3）。增加桃金娘果實提取的多酚樣品對ABTS+·清除率表現為先升高再趨于平穩，濃度和活性存在正相關，多酚質量濃度超過25 μg/mL后，仍保持98.4%的高清除率。而陽性對照中抗壞血酸濃達到20 μg/mL后，清除率活性穩定并達到100%。通過Origin 2018軟件擬合，桃金娘多酚對ABTS+·的半抑制濃度（IC50）為10.93 μg/mL，對照品VC的IC50為8.52 μg/mL，這一結果顯示，根據前期條件優化試驗獲得的桃金娘多酚樣品有很好的清除ABTS+·能力，與同濃度的抗壞血酸效果相近。

圖3 桃金娘多酚對ABTS+·清除作用

2.3.2 清除DPPH自由基活性

試驗結果顯示，桃金娘多酚清除DPPH的能力較強（見圖4）。桃金娘果實提取的多酚濃度與其對DPPH清除率也符合正相關量效關系，待質量濃度超過10.75 μg/mL后保持83.77%左右的DPPH清除率，略低于對照品抗壞血酸的清除活性（93.79%），經Origin 2018軟件擬合，對于自由基DPPH，桃金娘多酚的IC50為4.47 μg/mL（對照品VC的IC50為1.12 μg/mL）。對于自由基DPPH，桃金娘多酚表現出較強的清除能力，約為濃度相當時VC清除DPPH能力的89.3%。

3 結論

在使用乙醇浸提法提取桃金娘果實多酚的單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken響應面優化試驗設計軟件確定的最佳工藝條件：乙醇體積分數45%、提取溫度76 ℃、料液比1∶95（g/mL），所得桃金娘多酚提取量為32.58±0.24 mg GAE/g。通過比較不同濃度下的桃金娘多酚與對照品維生素C體外抗氧化活性發現，對于ABTS+·與DPPH，桃金娘多酚皆表現出較強的清除活性，抗氧化能力接近維生素C的水平，其清除ABTS+·自由基、DPPH自由基半抑制濃度（IC50）分別為10.93和4.47μg/mL。試驗結果可為野生桃金娘多酚的進一步開發利用及抗氧化活性產品的研發提供理論依據。