響應面法優化提取百香果皮花色苷類色素及其穩定性研究

王鑫蒙，艾春辛，趙文靜，石彬，張偉*，郭嬌*

1.新鄉學院化學與材料工程學院（新鄉 453003）；2.新鄉市博源科技有限公司（新鄉 453003）

百香果果皮中含有花色苷類成分[1]，花色苷類色素在自然界中分布較為廣泛，是沒有毒性且資源較為豐富的天然色素，它可以保護心血管、抗氧化、抗腫瘤，且具有清除自由基、調節免疫功能等生理功能[2-3]。

國內外研究報道花色苷類物質的提取方法有超臨界流體萃取法[4]、超聲波輔助提取法[5]、酶法[6]、高壓脈沖電場[7]、微波萃取法[8]。這些方法較為復雜、對設備要求較高，而溶劑萃取法[9]比較溫和，對花色苷類色素的破壞性小。溶劑萃取法對百香果皮中的花色苷類色素提取的相關研究尚未見諸報道，試驗采用響應面法優化溶劑萃取提取花色苷類色素的條件并對其穩定性進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

紫皮百香果（廣西壯族自治區，網購）；無水乙醇、過氧化氫、亞硫酸鈉、鹽酸、蔗糖（均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；定性濾紙（杭州特種紙業有限公司）。

1.2 試驗儀器與設備

UV-1600紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；電子天平（梅特勒托利多）；標準篩（紹興市上虞區豪泉篩具廠）；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱（廣州番禺旭東阪田電子有限公司）；pH計（梅特勒-托利多公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 花色苷類色素的提取

將購買的紫皮百香果洗凈去除內表皮后放烘箱內，溫度40 ℃烘干12 h取出打碎過0.25 mm標準篩備用；準確稱取1.00 g原料于比色管中，以鹽酸酸化的60%乙醇為提取劑，在溫度50 ℃、料液比1∶30（g/mL）的條件下水浴浸提2 h后用抽濾裝置進行處理；取1 mL濾液用緩沖液定容到10 mL，靜置2 h后，在510 nm處測定花色苷類溶液的吸光度，并將其結果帶入式（1）[10]計算溶液花色苷含量（mg/L），通過式（2）[10]計算花色苷提取率（mg/g）[11-12]。

式中：A為510 nm處吸光度；MW為花色苷相對分子質量，465；DF為稀釋倍數；ε為摩爾消光系數，35 481；l為比色皿光程（1 cm）。

式中：c為溶液中花色苷質量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；m為原料質量，g。

1.3.2 花色苷類色素穩定性的分析

將單因素試驗獲得的濾液用來做穩定性分析。

1.3.2.1 光照穩定性分析

分別取適量的濾液于透明和棕色容量瓶中，透明容量瓶放置光照處，棕色容量瓶放置暗處，連續7 d取1 mL 2種光照條件下的濾液，用緩沖液定容到10 mL，靜置2 h測吸光度。

1.3.2.2 蔗糖濃度穩定性分析

分別稱取0，0.1，0.2，1.0，1.5，2.0和2.5 g的蔗糖于10 mL的蒸餾水中配制成不同濃度的蔗糖溶液定容濾液，空白樣用蒸餾水定容，靜置2 h測定吸光度。

1.3.2.3 氧化劑穩定性分析

用蒸餾水將H2O2配制成1%，2%，3%，6%和15%的溶液定容濾液，空白樣用蒸餾水定容，靜置2 h測定吸光度。

1.3.2.4 還原劑穩定性分析

用蒸餾水將Na2SO3配制成10，20，30，40和60 g/L的溶液定容酸性花色苷類溶液，空白樣用蒸餾水定容，靜置2 h測定吸光度。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗花色苷類色素提取工藝的優化

2.1.1 提取時間對花色苷類色素提取效果的影響

如圖1所示：花色苷類色素提取率在提取時間1 h處達到最大，超過1 h之后提取率逐漸下降；同時提取時間加長，花色苷類色素會受熱分解，使生產周期變長，能耗增加，生產成本變高，所以最佳提取時間為1 h。

2.1.2 提取溫度對花色苷類色素提取效果的影響

如圖2所示：溫度升高時，提取液含有的花色苷類色素含量先升高后降低；溫度上升到30 ℃，花色苷類色素的提取率最高；溫度繼續升高時，花色苷類色素的提取率下降。這可能與花色苷類色素受熱分解有關，因此最佳提取溫度為30 ℃。

圖2 不同提取溫度下花色苷類色素的提取率

2.1.3 pH對花色苷類色素提取效果的影響

如圖3所示，pH提高時，花色苷類色素的提取率在pH 3時達到最大，之后呈現降低趨勢，又因為花色苷類色素在中性和弱堿條件下不穩定[11]，所以最佳pH為3。

圖3 不同pH下花色苷類色素的提取率

2.1.4 料液比對花色苷類色素提取效果的影響

如圖4所示，料液比逐漸減小時，花色苷溶液的吸光度也變得越小，選擇料液比1∶20（g/mL）最佳。

圖4 不同料液比下花色苷類色素的提取率

2.1.5 原料粉碎粒度對花色苷類色素提取效果的影響如圖5所示：粒度從0.18 mm到0.83 mm的過程中，花色苷類色素含量的提取率緩慢下降；由于每2點間的斜率在逐漸減緩，且0.18 mm對設備要求偏高，也會增大物料、能源的消耗。所以選擇過篩的物料粒度0.25 mm最佳。

圖5 不同粒度下花色苷類色素的提取率

2.1.6 乙醇體積分數對花色苷類色素提取效果的影響

如圖6所示，乙醇體積分數對溶液中花色苷類色素含量的影響曲線高低起伏，60%時花色苷類色素提取率達到最大。因此選擇乙醇體積分數60%最佳。

圖6 不同乙醇體積分數下花色苷類色素的提取率

2.2 花色苷類色素提取工藝優化Box-Behnken試驗結果與分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

在單因素試驗基礎上，以花色苷類色素的提取率（Y）為響應值，以花色苷類色素提取率有顯著影響的提取時間（X1）、提取溫度（X2）、乙醇體積分數（X3）和提取液pH（X4）為考察因素，對提取花色苷類色素的最佳工藝進行響應面分析，Box-Behnken試驗因素[13]與水平見表1，試驗結果與分析見表2。對回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表1 花色苷類色素提取工藝條件優化Box-Behnken試驗因素與水平

表2 花色苷類色素提取工藝條件優化Box-Behnken試驗結果與分析

如表3所示，模型概率值P＜0.000 1顯著，失擬項P＞0.05不顯著，說明所建立的模型極顯著，可以較好地擬合花色苷類色素的提取條件。通過方差分析，由P值可知各因素影響強弱次序：提取時間＞提取溫度＞提取劑pH＞乙醇體積分數。提取時間、提取溫度對結果有極顯著影響（P＜0.01），提取劑pH有顯著影響（P＜0.05）。

表3 響應面試驗結果方差分析

2.2.2 百香果外果皮花色苷類色素響應面分析

四因素交互作用對花色苷類色素提取率影響的響應面曲線及等高線見圖7～圖9。

圖7 時間與溫度、乙醇體積分數交互作用對花色苷類色素提取率影響的響應面和等高線

圖8 pH與乙醇體積分數、時間交互作用對花色苷類色素提取率影響的響應面和等高線

圖9 溫度與pH、乙醇體積分數交互作用對花色苷類色素提取率影響的響應面和等高線

結果表明：固定提取時間，當乙醇體積分數、提取劑pH增大時，溶液中花色苷類色素含量呈現先增加后降低趨勢；提取時間、乙醇體積分數兩因素交互影響的等高線未閉合但是響應面呈凸形，說明二項式提取時間影響大；提取時間、提取劑pH兩因素交互影響的等高線未閉合但是響應面呈凸形，說明二項式提取劑pH影響大；分析結果和表3中的顯著性一致。

利用Design-Expert 11軟件對所得的回歸方程進行回歸分析，確定最佳工藝參數時間1.555 h、提取溫度55.281 ℃、乙醇體積分數65.186%、提取劑pH 2.424，此時花色苷類色素提取率預測值為3.508 mg/g。為了方便實際操作，將最佳工藝參數修改為提取時間1.5 h、提取溫度55 ℃、乙醇體積分數65%、提取劑pH 2.4，在此最優條件下，花色苷類色素的提取率為3.520 mg/g，與模型預測值3.508 mg/g較一致，驗證模型的可靠性。

2.3 花色苷類色素的穩定性分析

2.3.1 光照對花色苷類色素穩定性的影響

如圖10所示，60%乙醇提取出來的花色苷類溶液在避光條件下吸光度高于光照條件下的溶液吸光度。吸光度越高，說明色素殘存越多，色素越穩定。因此，避光條件有利于色素的保存。

圖10 光照對花色苷類色素穩定性的影響

2.3.2 蔗糖濃度對花色苷類色素穩定性的影響

如圖11所示，整體對比空白樣可知，在同一波長下，蔗糖濃度越高，溶液吸光度越高，說明色素殘存越多，色素越穩定。因此，蔗糖濃度對花色苷類色素的穩定性有影響，蔗糖濃度越高，對花色苷類色素保護作用越強。

圖11 蔗糖濃度對花色苷類色素穩定性的影響

2.3.3 氧化劑對花色苷類色素穩定性的影響

如圖12所示，在同一波長下，氧化劑濃度越大，花色苷類溶液的吸光度越低，說明色素殘存越少，色素越不穩定。因此，氧化劑對花色苷類色素的穩定性有顯著影響，花色苷類色素抗氧化性能較差。

圖12 氧化劑對花色苷類色素穩定性的影響

2.3.4 還原劑對花色苷類色素穩定性的影響

如圖13所示，整體對比空白樣可知，在同一波長下還原劑濃度越高，花色苷類溶液的吸光度越高，說明色素殘存越多，色素越穩定。因此，還原劑對Na2SO3具有一定的保護作用，花色苷類色素的耐還原性較好。

圖13 還原劑對花色苷類色素穩定性的影響

3 結論

以百香果為原料，以花色苷類色素提取率為響應值，通過單因素試驗和響應曲面法確定花色苷類色素提取的最佳工藝參數：百香果皮干燥的粒度0.25 mm過篩、提取時間1.5 h、提取溫度55 ℃、乙醇體積分數65%、pH 2.4、液料比1∶20（g/mL）。在此最優條件下，花色苷類色素的提取率為3.520 mg/g，與模型預測值較一致。

同時，試驗對花色苷類色素的穩定性進行研究分析，結果表明避光、蔗糖濃度越高、氧化劑濃度越小、還原劑濃度越大，越有利于花色苷類色素穩定。試驗結果為花色苷類色素的實際生產和儲存條件提供理論依據。