仙草家園山豬肉對環磷酰胺誘導小鼠骨髓抑制的改善

劉嘉瑩，劉瑩，李育銀，梁曉文，章力建，黃松*

1.廣州中醫藥大學中藥學院（廣州 440100）；2.廣州市天下農王農業有限公司（廣州 440100）；3.國家農產品質量安全風險評估專家委員會（北京 110000）

豬肉是日常食物中的重要營養來源[1]。據研究報道發現，在豬肉中含有鈣、鈉和鐵等微量元素，鐵在豬肉中的含量較高，可有效補充人體紅細胞的生成和功能維持所需[2]。豬肉中含有豐富的蛋白質，這也是豬肉營養物質的主要來源，且豬肉的氨基酸與人類的氨基酸相似，更有利于營養吸收[3]。高蛋白的食物也可以補充身體的營養進而提高身體的免疫力。但現階段廣大消費者對于豬肉的需求不再停留在量上，逐漸開始對豬肉的品質有了更高要求。豬肉品質的影響因素中自身營養物質主要包括豬肉中微量元素、蛋白質和糞臭素等方面，同時飼料營養因素也是影響豬肉品質的重要因素。有眾多學者報道以中藥為飼料添加劑的豬肉中的中藥具有不易產生耐藥性，低或無殘留和毒性的飼料添加劑，在畜禽生產中還具有促進動物生長、提高動物生產性能和改善動物產品品質的應用[4]。因此，以中藥飼料為添加劑的山豬肉的品質比市售豬肉的營養價值更高。

豬肉性平、味甘、咸、無毒；入脾、胃、腎經；主要有補腎養血、滋陰潤燥之功效。治療病后體弱，產后血虛，皆可作為補益食療之品[5]。因此，豬肉往往是癌癥患者康復時的補益食療之品。臨床上，癌癥患者多采用化療藥環磷酰胺進行治療，化療藥環磷酰胺在殺傷腫瘤細胞的同時也會殺傷正常細胞[6-8]，尤其是骨髓細胞受化療藥的損傷嚴重，骨髓抑制也是化療藥對患者的人體機能帶來嚴重不良影響之一[9]。因此，豬肉有助于改善環磷酰胺誘導的骨髓抑制。

以中藥為飼料添加劑的豬肉對機體骨髓抑制改善的相關報道極少，因此，試驗采用環磷酰胺化療藥誘導建立骨髓抑制的小鼠模型。觀察仙草家園山豬肉在骨髓抑制方面的改善作用，為仙草家園山豬肉的生產及推廣提供基礎數據支撐，助力養豬畜牧產業發展，并為以中藥飼料為添加劑豬肉的開發和應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品組為仙草家園山豬肉，由廣州市仙草家園科技有限公司生產企業提供；對照組為市售豬肉。

KM小鼠144只：6～8周齡，雌雄各半，SPF級，體重20±2 g，由珠海百試通生物科技有限公司提供，動物合格證明SCXK（粵）2020-0051，飼養于廣州中醫大學（大學城）實驗動物中心；環磷酰胺粉劑（17011325，江蘇盛迪醫藥有限公司）；生理鹽水（3B15092607，山東齊都藥業有限公司）；鈣（Ca）試劑盒（C004-2-1）、堿性磷酸酶（ALP/AKP）測定試劑盒（A059-2-2）、磷（Pi）測試盒（C006-1-1）、銅（Cu）測定試劑盒（E010-1-1）、鋅（Zn）試劑盒（E011）：南京建成生物科技公司；鐵（Fe）試劑盒（TC1015，雷根生物有限公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（大連美侖生物科技有限公司）；豬（Porcine）糞臭素（skatole）ELISA試劑盒（ZK-P9738，深圳子科生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

電子天平（ME204E，Mettler Toledo公司）；電子天平（PL3001-S，Mettler Toledo公司）；冷凍高速離心機（Fresco-17，Thermo Fisher Scientific）；酶標儀（Multiskan，Thermo Fisher Scientific）；GO全波長酶標儀（Thermo Fisher公司）；勻漿機（VCX 130PB，SONICS MATERIALS INC）。

1.3 樣品和對照品制備

將5 kg市售豬肉和5 kg仙草家園山豬肉分別用清水洗凈，放入鍋中加水煮熟，撈出，用吸水紙擦干表面水分，切成等量小塊，全部放入冷凍干燥機至2 d，取出，于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.4 營養成分分析

1.4.1 微量元素的測定

鈣（Ca）、銅（Cu）、鋅（Zn）的測定分別采用Ca試劑盒、Cu測定試劑盒、Zn試劑盒。

1.4.2 蛋白質的測定

采用BCA蛋白檢測試劑盒。

1.4.3 糞臭素的測定

采用豬（Porcine）糞臭素（skatole）ELISA試劑盒。

1.5 構建小鼠骨髓抑制模型

參照譚麗等[10]方法稍作修改，隨機分為正常組、模型組、市售樣品低劑量組（5 g/kg）、市售樣品高劑量組（10 g/kg）、仙草家園樣品低劑量組（5 g/kg）、仙草家園樣品高劑量組（10 g/kg）。其中，12只作為正常對照鼠，剩余小鼠腹腔注射化療藥環磷酰胺注射40 mg/kg，每天1次，連續注射5 d，根據前期研究，造模第5天骨髓抑制模型成立。后續減少注射至20 mg/kg，隔天1次，連續注射至15 d后，停止藥物的注射。

1.6 脾臟和胸腺指數測定

連續喂養豬肉25 d后禁食不禁水；24 h后頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠脾臟、胸腺，用濾紙吸干臟器表面的血漬，稱重記數，計算脾臟指數及胸腺指數。按式（1）計算。

脾臟指數=脾臟質量（mg）/體重（g）（1）

1.7 血常規含量測定

小鼠摘眼球取血，取50 μL用抗凝管儲存，采用全自動血生化儀檢測血常規指標，包括白細胞計數（WBC）、紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）。

1.8 血清中Ca、P、AKP含量測定

試驗前小鼠禁食24 h，禁食期間自由飲水。隨后采用麻醉劑麻醉動物并眼眶靜脈中取血，全血靜止2 h后于3 500 r/min（-4 ℃）低溫離心15 min，取上層血清于-80 ℃保存，用于后續Ca、P、AKP指標檢測。

1.9 統計學分析

試驗結果用SPSS 20.0統計軟件，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）的方法進行統計，試驗所得數據以±S表示，當P＜0.05時認為有統計學意義，P＜0.01時認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 營養成分分析

2.1.1 微量元素成分分析

表1 微量元素成分分析

微量元素成分分析結果見圖1。仙草家園組與市售組相比，豬肉中鈣離子含量有明顯增加，有顯著差異（P＜0.05），其他Fe、Zn、Cu均無明顯差異。這可能與仙草家園中藥飼料含有強健筋骨的中草藥有關。

2.1.2 蛋白質和糞臭素成分分析

蛋白質成分分析結果見圖2。仙草家園組在豬肉中總蛋白質含量方面均顯著高于市售組，有顯著差異（P＜0.05），具有統計學差異，表明仙草家園樣品組在蛋白質含量方面較市售組更優。優質的蛋白質可以提高生物體的免疫力，提示仙草家園樣品組可能在在免疫調節方面更優于市售組。仙草家園豬苗采用中藥飼料進行喂養，其豬肉糞臭素的含量明顯低于市售豬肉，提示中藥飼料喂養后可能通過改善豬體內腸道菌群平衡從而改善豬肉膻味。

2.2 脾臟和胸腺指數測定

由表3可知，模型組雄鼠脾臟指數明顯升高，與正常組相比差異極顯著（P＜0.01），提示環磷酰胺對雄鼠脾臟器官有顯著的抑制作用，即環磷酰胺致雄鼠骨髓抑制模型構建成功。市售組和仙草家園組均可使骨髓抑制雄鼠的脾臟指數降低，說明2種豬肉均可以抑制脾臟腫大，即2種豬肉對骨髓抑制雄鼠脾臟指數有很強的恢復促進作用。市售組和仙草家園組均可極顯著降低脾臟指數（P＜0.01），與市售組相比，仙草家園組降低脾臟指數更明顯，與正常組脾臟指數的數據更接近，說明仙草家園組較市售組對脾臟指數的恢復有更好的促進作用。

表3 兩種豬肉對骨髓抑制雄性和雌性小鼠脾臟指數的影響（±S，N=12）

表3 兩種豬肉對骨髓抑制雄性和雌性小鼠脾臟指數的影響（±S，N=12）

類別 組別 劑量/(g·kg-1) 脾臟指數/(mg·g-1)雄正常組 - 2.42±0.33模型組 - 5.47±4.01##市售低劑量組 5 3.55±2.57**市售高劑量組 10 4.22±2.56**仙草家園低劑量組 5 3.21±1.61**仙草家園高劑量組 10 3.48±0.88**雌 正常組 - 3.18±0.73模型組 - 5.01±2.54##市售低劑量組 5 4.48±2.35市售高劑量組 10 5.16±1.36仙草家園低劑量組 5 3.53±0.56**仙草家園高劑量組 10 3.35±0.68**注: 與空白組比較, #表示P＜0.05, ##表示P＜0.01; 與模型組比較,*表示P＜0.05, **表示P＜0.01 (n=12)。

另外，模型組雌鼠脾臟指數明顯升高，與正常組相比差異極顯著（P＜0.01），提示環磷酰胺對雌鼠脾臟器官有顯著的抑制作用，即環磷酰胺致雄鼠骨髓抑制模型構建成功。市售組和仙草家園組均可使免疫抑制雌鼠的脾臟指數的降低，市售組對免疫抑制雌鼠的脾臟指數的降低無明顯差異，仙草家園組對免疫抑制雌鼠的脾臟指數的降低有極顯著差異（P＜0.01），表明仙草家園組較市售組在骨髓抑制方面上有更好干預作用。

2.3 血常規含量測定

雄鼠中，與模型組相比，市售豬肉劑量組和仙草家園樣品劑量組RBC、HGB、PLT有升高趨勢，均具有顯著的統計學差異（P＜0.05）。在WBC指標中，仙草家園高劑量組具有統計學差異（P＜0.05）。與市售組相比，在WBC、RBC、HGB、PLT這4個指標中，仙草家園產品組改善效果更明顯，表明仙草家園產品能夠從體內相比市售組能更好改善骨髓抑制。

另外，雌鼠中，與模型組相比，各劑量組的升高的趨勢與雄鼠中的指標相似，這可能與豬肉中具有豐富的半胱氨酸，以及血紅素可顯著改善貧血等相關。此外，與市售組相比，仙草家園樣品組升高的趨勢更加明顯，表明仙草家園樣品組可能具有比市售組更強的改善效果。

表4 兩種豬肉對骨髓抑制雄性和雌性小鼠外周血細胞含量測定的影響（±S，N=12）

表4 兩種豬肉對骨髓抑制雄性和雌性小鼠外周血細胞含量測定的影響（±S，N=12）

類別 組別 劑量/(g·kg-1) WBC/(109·L-1) RBC/(1012·L-1) HGB (g·L-1) PLT/(109·L-1)雄正常組 - 5.7±0.73 8.13±0.36 128.86±18.86 1 503.50±259.18模型組 - 3.4±0.77# 4.36±0.97## 92.22±5.07## 1 015.56±87.89##市售低劑量組 5 3.76±1.48 6.38±0.35** 108.00±4.82** 1 184.25±113.24*市售高劑量組 10 4.64±1.80 6.81±0.86** 111.89±9.39** 1 278.22±156.86**仙草家園低劑量組 5 4.96±1.86 7.03±0.63** 117.15±4.81** 1 242.00±102.51**仙草家園高劑量組 10 4.78±1.14* 6.63±0.39** 121.25±2.94** 1 363.30±91.84**雌正常組 - 5.60±1.79 7.03±0.36 128.17±20.09 1 503.44±192.89模型組 - 2.51±0.65## 4.60±0.97## 92.22±5.12## 1 183.13±46.37##市售低劑量組 5 3.31±0.69 6.11±0.35** 111.80±3.09 1 015.25±100.43*市售高劑量組 10 4.55±1.18** 6.39±0.58** 117.00±8.18* 1 175.56±87.93仙草家園低劑量組 5 4.12±0.71* 7.07±0.33** 116.10±31.29** 1 229.73±127.79仙草家園高劑量組 10 4.94±1.49** 7.16±0.67** 118.90±6.07** 1 415.20±124.78**注: 與空白組比較, #表示P＜0.05, ##表示P＜0.01; 與模型組比較, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01 (n=12)。

2.4 血清中Ca、AKP、P含量測定

與模型組相比，雄鼠各劑量組的Ca含量均有升高趨勢，其中仙草家園樣品高劑量組血清中Ca含量最高，達9.76 mg/100 mL，統計學差異最明顯（P＜0.01）。另外，與模型組相比，雄鼠的市售高劑量組和仙草家園樣品組均有升高趨勢，其中仙草家園樣品低劑量組的AKP含量最高，達13.36金氏單位/100 mL，有極顯著差異（P＜0.01）。在P含量指標上，正常組和模型組沒有產生明顯差異，無統計學意義（P＞0.05），市售組與模型組無明顯差異，仙草家園樣品組比市售組的干預效果更好。

另外，雌鼠中與模型組相比，各劑量組的Ca含量均有升高趨勢，其中仙草家園樣品高劑量組Ca含量最高，達9.44 mg/100 mL，統計學差異最明顯（P＜0.01）。另外，與模型組相比，雌鼠AKP含量的市售高劑量組和仙草家園樣品組有明顯差異，其中仙草家園樣品高劑量組AKP含量最高，達13.40金氏單位/100 mL。

表5 兩種豬肉對骨髓抑制雄性和雌性小鼠血清Ca、AKP、P含量的影響（±S，N=12）

表5 兩種豬肉對骨髓抑制雄性和雌性小鼠血清Ca、AKP、P含量的影響（±S，N=12）

類別 組別 劑量/(g·kg-1) Ca/(mg·100-1 mL) AKP/(金氏單位·100-1 mL) P/(mg·100-1 mL)雄正常組 - 9.59±1.43 17.80±1.83 11.26±2.34模型組 - 6.27±0.84## 8.61±1.25## 8.75±1.01市售低劑量組 5 7.29±0.71 8.83±1.83 8.70±0.85市售高劑量組 10 7.83±0.76* 10.40±1.99 8.56±1.18仙草家園低劑量組 5 7.77±0.76* 13.36±2.68** 10.38±1.44仙草家園高劑量組 10 9.76±0.99** 11.80±1.51* 10.61±1.70雌正常組 - 9.39±1.28 14.27±1.81 11.00±1.29模型組 - 5.00±1.03## 8.76±1.49## 10.35±1.87市售低劑量組 5 6.00±0.97 10.26±1.83 10.61±2.14市售高劑量組 10 7.56±0.83* 12.74±1.43** 9.27±0.93仙草家園低劑量組 5 7.04±1.24 11.41±0.89* 10.96±1.26仙草家園高劑量組 10 9.44±0.99** 13.40±1.59** 9.39±1.81注: 與空白組比較, #表示P＜0.05, ##表示P＜0.01; 與模型組比較, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01 (n=12)。

3 討論

試驗表明，仙草家園產業生產的以中藥為飼料添加劑的豬肉，與市售豬肉相比，在體外試驗對2種豬肉微量元素、蛋白質比例和糞臭素指標的測定上，仙草家園山豬肉比市售豬肉的Ca含量、豬肉的蛋白質含量更高，糞臭素含量更低，改善豬肉的膻味，表明仙草家園山豬肉比市售豬肉的口感更好、蛋白質更豐富、補鈣效果更強，根據豬肉Ca含量和蛋白質含量的結果猜想仙草家園山豬肉可能對骨髓抑制有較好的干預效果。因此，建立由化療藥環磷酰胺誘導的骨髓抑制的模型組，分別用2種豬肉進行喂養。

何丹[11]用戊二醛聚合豬血紅蛋白（pPolyHb），可以提高貧血動物血紅蛋白含量，通過測定外周血細胞的含量，從而改善化療藥環磷酰胺誘導的骨髓抑制。試驗結果顯示仙草家園樣品組可以提高化療藥環磷酰胺誘導的骨髓抑制小鼠的外周血細胞中WBC、RBC、HGB、PLT和降低脾臟指數，抑制脾臟腫大，且比市售豬肉組有更好的干預效果。

骨髓抑制往往也會帶來骨質疏松的影響，因此會導致體內的Ca和AKP含量的流失[12]。同時，仙草家園山豬肉可以提高化療藥環磷酰胺誘導的骨髓抑制小鼠的Ca含量和AKP含量，且比市售豬肉的干預效果更好，對骨頭的發育有更好促進作用。這提示中藥對豬肉品質的改善作用，同時在日常食用中對健康方面具有一定保護作用。同時，也說明仙草家園山豬肉比市售豬肉對骨髓抑制的改善效果更強。

通過聚焦于以中藥飼料喂養的仙草家園山豬肉，探究仙草家園山豬肉與市售豬肉對化療藥環磷酰胺誘導的骨髓抑制的不同改善作用。進一步為養豬畜牧業研發與推廣提供科技支持。但仍有很多需要繼續深入研究的內容，仙草家園山豬在體改善骨髓抑制的具體機制還有待深入探討。為明確仙草家園山豬對骨髓抑制的作用機制，有待對仙草家園山豬對小鼠體外細胞中各骨髓抑制指標的影響及仙草家園山豬中各有效物質的作用機制等開展深入研究。