基于電子鼻探究不同發酵劑對凝固型酸羊乳的影響

劉亞文，劉珊珊，石艷，韓金蓮，白麗娟*

1.錦州醫科大學食品與健康學院 遼寧省肉類加工與質量安全控制專業技術創新中心（錦州 121000）；

2.錦州市檢驗檢測認證中心（錦州 121000）；3.盤錦宋大房食品有限公司（盤錦 124000）

羊奶以其營養豐富、容易吸收等優點被視為乳品中的精品，被譽為“奶中之王”，同時也是世界上公認的最接近人乳的可開發乳品[1]。并且山羊奶還具有更好的消化率、低過敏性、更高的緩沖能力和更高的pH[2]。雖然鮮羊奶有多種優點，但其膻味導致不少消費者對鮮羊奶制品望而卻步[3]。如果將羊奶經過發酵制成酸奶產品，不僅在一定程度上弱化了羊奶的膻味，更好地提升了羊奶的口感，同時更優化了鮮羊奶的營養價值[4]。蘇偉麗等[5]通過設置不同的變量成功探究出生產低膻味酸羊奶的最佳工藝條件。陳合等[6]從牛奶發酵劑中篩選出適用于羊奶發酵的菌種，并完成對凝固型酸羊奶發酵工藝的優化。李瑩等[7]通過響應曲面法對生產山羊酸奶的配方與發酵工藝進行了優化。張富新[8]通過大量試驗證實了羊奶發酵成酸奶是可行的。山羊乳酸奶由于具有較高的營養成分和生物活性肽，可提供極好的健康價值[9]，山羊奶具有開發為功能性食品的潛力，特別是針對炎癥性腸病和消化不良人群[10]。目前國際上羊奶產品研究開發較為廣泛，而我國羊奶加工以奶粉及液態奶居多[11]。市場上對酸牛奶的推廣較多，酸羊奶的開發還有很大空間，所以酸羊奶的研究開發具有重要意義，能更好地彌補羊奶市場的空缺，是一片值得推進的綠色發展新領域。電子鼻技術可以監測羊奶發酵前后不同階段揮發性成分的變化，為進一步研究發酵羊奶能夠降低羊奶膻味的機理奠定基礎[12]。

該試驗采用3種發酵劑（YO-MIX883、YOMIX300、YO-MIX900）分別發酵成以鮮羊乳為原料的凝固型酸羊乳，通過不同發酵劑添加量、加糖量、發酵溫度與發酵時間的單因素試驗及響應面設計來優化凝固型酸羊乳的工藝參數，并利用電子鼻對酸羊乳的風味穩定性進行檢測，以期獲得凝固型酸羊乳生產的最優發酵劑及工藝參數，用于工業生產，彌補市場空缺。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

羊奶（九羊純羊奶）；白砂糖（市售，一級）；發酵劑（丹尼斯克菌種，型號YO-MIX883，YOMIX300和YO-MIX900）；氫氧化鈉（濟南盈動化工有限公司）；酚酞指示劑（國藥集團化學試劑有限公司）；PEN3型電子鼻（德國AIRDENSE公司）；BCD-215KS冰箱（青島海爾股份有限公司）；C21-Simple101美的電磁爐（美的集團有限公司）；SWCJ-1F型超凈工作臺（蘇州安泰有限公司）；GHP-9270隔水式恒溫培養箱（上海-恒科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 凝固型酸羊乳的制備

發酵劑的預處理：將3種發酵劑活化，并以4%的添加量分別接種到滅菌后的鮮羊乳中，在43±1 ℃恒溫箱中培養3～4 h，置于4 ℃或5 ℃冰箱備用。

成品羊奶→加熱（75±1 ℃）→配料混合（6%白砂糖）→殺菌（95 ℃，5 min）→冷卻→接種發酵劑（4%）→灌裝→發酵（43±1 ℃，3～4 h）→冷卻→放入冰箱后發酵→成品

1.2.2 不同發酵條件對凝固型酸羊乳風味的影響

在單因素試驗中，將制備的YO-MIX883、YOMIX300、YO-MIX900發酵劑分別以2%，3%，4%，5%和6%的接種量分別接種到加糖量為2%，4%，6%，8%和10%的殺菌過后的羊乳中，再分別放入39，41，43，45和47 ℃的隔水式恒溫培養箱中發酵3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 h。將上述各項單因素試驗后形成的凝固型酸羊乳在4 ℃冰箱后熟，依次進行感官評定和酸度檢測，探究不同發酵劑添加量、加糖量、發酵時間和溫度對凝固型酸羊乳風味的影響。

1.2.3 響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，設定發酵劑接種量、加糖量、發酵溫度、發酵時間為4個因素，分別取3個水平，以酸羊乳的感官評分為響應值，通過響應面分析法對四因素三水平進行試驗設計，響應面分析因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平表

1.2.4 酸羊乳的感官評價標準

邀請10名食品評審員對制得的酸羊乳進行品嘗，對產品的風味、色澤、口感和組織狀態4個方面進行評價計分。

表2 酸羊奶感官評分標準

1.2.5 電子鼻的檢測

分別量取10 mL發酵后在4 ℃冰箱存放1，4，7，10和13 d的樣品置于30 mL樣品瓶中，用封口膜封口，在溫度30 ℃條件下靜置5 min后直接將進樣針頭插入樣品瓶，采用頂空吸氣法進行電子鼻分析試驗。電子鼻測定參數：清洗時間120 s、歸零時間5 s、預進樣時間5 s、測定時間60 s[13-14]、載氣流速300 mL/min。每個樣品測定3次。電子鼻各傳感器信息見表3。

表3 電子鼻傳感器所對應的氣味類型

1.2.6 凝固型羊奶酸奶酸度的測定

羊奶酸奶酸度的測定按 GB 5409—85方法[15]，酸度用吉爾涅爾度（°T）表示。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0進行統計分析，定量資料應用均數±標準差表示，先行方差齊性檢驗，依條件行t檢驗、方差分析等，以P＜0.05為差異顯著，有統計學意義，繪圖采用Excel 2010。主成分分析法（Principal Component Analysis，PCA）、線性判別分析法（Linear Discriminant Analysis，LDA）[16]，用Winmuster軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 不同發酵條件對凝固型酸羊乳品質的影響

2.1.1 不同發酵劑接種量對凝固型酸羊乳風味的影響

將3種發酵劑分別以2%，3%，4%，5%和6%的接種量接種到加糖量為6%的殺菌過后的羊乳中，在43℃的隔水式恒溫培養箱中發酵4 h，發酵至凝固后進行感官評定，隨后進行滴定酸度的測定，重復3次試驗。感觀評分及酸度變化如圖1所示。

圖1 不同發酵劑接種量對凝固型酸羊乳感官及酸度的影響

從圖1可知：YO-MIX883、YO-MIX300、YOMIX900三種型號的發酵劑均在接種量為4%時感官評分可達到較高分，MIX900最高達90分，發酵后的凝固型酸羊乳的風味醇正、組織結構細膩。在發酵劑過少的情況下酸甜比上會造成失衡，導致口感方面不被大眾所接受；在發酵劑過多的情況下會造成組織狀態方面的問題，例如乳清析出的狀況。并且從圖中柱狀圖中可以看出酸度隨著接種量的增大而增高，這可能是因為發酵劑接種量加大導致乳酸菌增多，在接種量4%時酸度84°T為酸奶的最宜酸度。綜上所述選用MIX900發酵劑、接種量為4%時最為適宜，并且試驗中發現可以通過菌種的發酵可消除羊乳中固有的膻味。從全圖中可以看到三種發酵劑對產品的影響依次為YO-MIX900＞YO-MIX300＞YO-MIX883。

2.1.2 不同加糖量對凝固型酸羊乳風味的影響

將3種發酵劑分別以4%的接種量接種于加糖量分別為2%，4%，6%，8%和10%的殺菌過后的羊乳中，在43 ℃的隔水式恒溫培養箱中發酵4 h，發酵至凝固后進行感官評定，隨后進行滴定酸度的測定，重復3次試驗。感觀評分及酸度變化如圖2所示。

從圖2可知，感官評分分數變化呈先上升后下降的趨勢，在加糖量大于6%時酸度得到了明顯降低，但凝固時間延長，這可能是因為糖影響了菌種的生長繁殖。因此加糖量為6%時凝固型酸羊乳的口感及風味最佳，酸甜比例適宜。并且從全圖中可以看到三種發酵劑對產品的影響依次為YO-MIX900＞YOMIX300＞YO-MIX883。

2.1.3 不同發酵溫度對凝固型酸羊乳風味的影響

將3種發酵劑分別以4%的量接種量，6%加糖量，依次在39，41，43，45和47 ℃的隔水式恒溫培養箱發酵4 h至凝固進行感官評分，隨后進行滴定酸度的測定，重復3次試驗。感觀評分及酸度變化如圖3所示。

從圖3可知，隨著發酵溫度的升高感官評分也隨之升高，整體呈先上升后下降的趨勢，這是因為發酵溫度可以直接影響酸羊乳發酵產品的品質，在發酵溫度過低時會造成凝乳狀態不佳，乳清析出，組織狀態粗糙的問題。當發酵溫度過低時也會造成乳清析出的問題，并且從上述柱形圖中可以看出酸度值隨著溫度的上升而上升，這是由于在高溫條件下乳酸會增多的原因，從而也是導致酸甜比失衡，感官評分降低的重要原因。圖中顯示43 ℃時感官評分最高，因此選用發酵溫度43 ℃對于凝固型酸羊乳發酵較為適宜，并且從全圖中可以看到三種發酵劑對產品的影響依次為YOMIX900＞YO-MIX300＞YO-MIX883。

2.1.4 不同發酵時間對凝固型酸羊乳風味的影響

將3種發酵劑分別以4%的接種量，6%加糖量，在43 ℃的隔水式恒溫培養箱發酵的條件下，依次在3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 h發酵時間下進行感官評分，隨后進行滴定酸度的測定，重復3次試驗。感觀評分及酸度變化如圖4所示。

圖4 不同發酵時間、不同發酵劑對樣品感官及酸度的影響

發酵時間對產品整體品質有著極大的影響，時間過長或過短都會造成產品風味的改變。從圖4可知，在發酵時間為4 h時感官評分達到最高值，因此選用發酵時間4 h進凝固型酸羊乳的制備，且從全圖中可以看到三種發酵劑對產品的影響依次為YO-MIX900＞YOMIX300＞YO-MIX883。

通過上述分析結果發現，3種發酵劑中YO-MIX900更為突出，相應的感官評分也優于YO-MIX300和YOMIX883，并且酸奶的標準酸度處于82～85 °T左右，所以發酵劑YO-MIX900為最適發酵劑，此條件下凝固型酸羊乳酸甜適口，口感細膩無顆粒，組織表面光滑。因此后續響應面優化試驗選用發酵劑YO-MIX900進行發酵并對其做出分析。

2.2 響應面優化凝固型酸羊乳試驗結果與分析

為確定凝固型酸羊乳的工藝參數，以發酵劑YOMIX900的接種量（A）、加糖量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）為試驗因素，利用Box-Behnken中心組合試驗設計，主要以感官評分為響應值（Y）。分析方案及結果如表4所示：

根據表4響應面分析結果，用軟件Design-Expert 8.0.6進行分析，得出結果，感官得分與各項因素的二次方程模型：Y=95.40+0.33×A+1.00×B+0.083×C-1.58×D-0.75×A×B-2.00×A×C+1.25×A×D-1.00×B×C+0.75×B×D+0.25×C×D-7.62×A2-7.62×B2-7.99×C2-6.24×D2。

表4 響應面分析方案及結果

根據表5可知，整體模型的P＜0.01，表明該模型顯著水平到達最優，并且其中的失擬項不顯著，并且R-Squared值為0.982 3，AdjR-Squared值0.964 6，都接近值1，Adeq Precision的值22.238大于4，說明該模型合理，可以看出各項因素與響應值之間的有較高的真實性。由F值可知，4個因素對凝固型酸羊乳品質的影響最大的是發酵時間，接下來依次的順序為加糖量、發酵劑接種量，最后是發酵溫度。

表5 回歸方程方差分析

根據回歸方程的分析，做出相應的3D曲面圖和等線圖，考察4個因素兩兩進行交互所擬合出的曲面圖形狀，進而分析對凝固型酸羊乳感官得分的影響。

圖7 發酵劑接種量與發酵時間對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應曲面圖及等高線

圖8 加糖量與發酵溫度對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應曲面圖及等高線

圖9 加糖量與發酵時間對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應曲面圖及等高線

響應面的坡度決定了兩兩因素交互作用對產品感官的顯著與否，坡度與顯著性呈正向相關，坡度越陡峭越顯著。等高線圖表示兩個因素之間的交互作用，呈橢圓時表示交互作用很大。試驗結果均符合以上特點。圖5～圖10表明：當發酵劑接種量、加糖量、發酵溫度和發酵時間的逐漸增加時，感官評分均呈先升高后下降的趨勢，并且可以看出因素發酵時間對凝固型酸羊乳的影響最大。結合響應面分析結果可知，最佳工藝參數為發酵劑接種量4%、加糖量6%、發酵溫度43 ℃、發酵時間4 h。對此條件下發酵出的凝固型酸羊乳進行感官評定，經過專業感官評價人員給分，重復3次，感官評價平均分數可以達到95分，相比較其他試驗組合評分位于前列。并且該條件下制成凝固型酸羊乳的成品經過品嘗之后受大眾喜歡。說明響應面優化后方案的可行性，但考慮后期的實際生產，為此進行驗證試驗，根據響應面優化試驗結果得出的最佳工藝參數進行試驗，重復3次做平行試驗，經過感官評定小組評定，重復3次的平均分數可以達到95分，與響應面軟件給出的預測值95.528相對偏差小于1%，表明該試驗的響應面優化試驗合理。

圖5 發酵劑接種量與加糖量對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應曲面圖及等高線

圖10 發酵溫度與發酵時間對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應曲面圖及等高線

2.3 利用電子鼻監測酸羊乳風味的變化

2.3.1 酸羊乳在保存中PCA主成分分析

在發酵劑YO-MIX900接種量4%，加糖量6%，發酵溫度43 ℃，發酵時間4 h條件下，將發酵好的酸羊乳，于4 ℃冷藏貯存13 d，分別在1，4，7，10和13 d利用電子鼻進行測定。圖中每個橢圓代表羊乳發酵不同時間的數據采集點。

圖11是YO-MIX900發酵劑制得的酸羊乳在4 ℃貯藏1～13 d過程中揮發性成分的PCA主成分分析圖。由圖11可知：第一主成分區分貢獻率為93.38%，第二主成分區分貢獻率為4.49%，兩個主成分貢獻率的和為97.87%，大于85%，所以這兩個主成分已經很好代表了樣品的主要信息特征。從圖11主成分PC1和PC2兩個主軸上來看，第1，第7和第13天的樣本比較近，第4天與第10天樣本較遠，各個樣本能夠明顯區分。說明電子鼻能較好區分貯存第1～第13天YO-MIX900發酵劑發酵的樣本酸羊乳，但是整體風味相差不大，說明產品貯存期間比較穩定。

圖11 YO-MIX900發酵劑酸羊乳5 ℃保存1～13 d PCA主成分貢獻率

2.3.2 酸羊乳在保存中LDA線性判別分析

圖12是YO-MIX900發酵劑制得的酸羊乳在4 ℃貯藏1～13 d過程中揮發性成分的LDA主成分分析圖。由圖12可知：第一主成分區分貢獻率為79.09%，第二主成分區分貢獻率為11.79%，兩個主成分貢獻率的和為90.88%，大于85%。從圖12可知：第4，第7和第10天風味差異明顯，第1和第13天樣本相近，說明YOMIX900發酵劑發酵的酸羊乳在保藏過程中揮發性成分（硫化氫、有機芳香硫化物和氮氧化合物為主）變化差別不是很大，因此風味雖有變化但不是特別明顯，即在保質期內無明顯變化，與風味變化不顯著的理論相吻合。綜上分析發現YO-MIX900發酵的酸羊奶在保存期內風味變化不顯著，氣味比較穩定，是比較理想的發酵劑。

圖12 YO-MIX900發酵劑酸羊乳5 ℃保存1～13 d LDA分析

3 結論

通過使用YO-MIX883、YO-MIX300、YOMIX900發酵劑，在不同發酵條件下發酵制得酸羊乳，經響應面優化試驗后并對酸羊乳在感官特性、貯存中風味變化以及發酵后酸羊乳酸度檢測，結果發現：發酵劑YO-MIX900在接種量4%、加糖量6%、發酵溫度43 ℃、發酵時間4 h獲得的酸羊乳風味穩定、酸味適中，且利用電子鼻對酸羊乳風味進行檢測，揮發性物質變化小，檢測結果較優，感官評定結果較佳，因此YO-MIX900是凝固型酸羊乳較理想的發酵劑，可用于工業生產。當前我國各地區出臺了各項奶業振興計劃，而羊奶是最適宜我國國民飲用的乳品，并且加工技術逐漸成熟，大有增長的勢頭，所以羊奶產業擁有光明的前景，相信將來羊奶開發產品可迎來空前的發展前景。