鯉科魚的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析

杜強，吳林菁*，曾圣，陳飛雄，趙飛，王艷艷

1.貴州省農業科學院水產研究所（貴陽 550025）；

2.貴州省特種水產工程技術中心（貴陽 550025）；3.貴州醫科大學（貴陽 550025）

鯉科魚（Cyprinidae），屬鯉形目，全世界共有鯉科魚類210屬3 700種以上。鯉科魚類分布在底棲或水中層，為卵生，雜食、草食或肉食魚類，是魚類中分布最廣、種類最多的一個科目[1]。我國自古有養殖鯉科魚的歷史，特別是在《中華人民共和國漁業法》確立“以養為主”的漁業發展戰略以來，極大地促進養殖技術發展，養殖產量和出口規模大幅提高，在水產品養殖和出口貿易中占據重要地位[2]。21世紀以來，中國水產養殖業快速發展，據2020年《中國漁業統計年鑒》數據，鯉科魚養殖產量超過全國淡水養殖主要魚類總產量的76%，是中國水產養殖主要品種[1]。伴隨著水產養殖規模的不斷擴大，隨之出現品質不一等問題，這一定程度上制約了水產養殖業的整體發展。

水產品的品質質量分析主要依靠單項指標按照國標檢測分析，該定量分析方法在全面反映其品質方面穩定性存在不知。相較于單項指標檢測，逐一檢測分析所需試驗試劑較多、操作者判別差異及較長試驗周期，指紋圖譜結合色譜和光譜等技術能獲得水產品品化學成分的特征譜圖，是水產品產地鑒別、真偽鑒別、優劣鑒別的有效工具，還可用于生產過程的質量控制，包括追蹤化學成分的變化、監測各批次產品質量的一致性和穩定性[3-4]。高效液相色譜是研究指紋圖譜應用最廣泛的方法之一，具有分離效能高、分析速度快及儀器自動化等特點，被應用于大多數的非揮發、熱不穩定的化合物的研究，被廣泛應用于動植物藥材品質研究中[2-3]，在部分特色水產品[如大黃魚（Larimichthys crocea）、馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）和鮑魚（Abalone）等][4-8]的質量控制和產地溯源中也可見報道。

因此，試驗通過檢測部分鯉科魚樣品，建立相關鯉科魚HPLC指紋圖譜，并通過聚類分析、主成分分析對其質量進行評價，旨在為水產品質量綜合評價分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國）；EYELA FD-1000真空冷凍干燥機[西崎貿易（成都）有限公司]；KQ-250B超聲清洗機（上海五久自動化設備有限公司）；BSA323S電子天平（上海皖衡電子儀器有限公司）。

甲醇、乙酸乙酯[均為分析純，科密歐試劑公司（天津）]；乙腈[色譜純，天地公司（美國）]。試驗所用樣品經貴州省水產研究所李正友研究員鑒定為鯉科類魚Cyprinus，分別采集于貴州省內遵義、銅仁、畢節等地（表1）。

表1 鯉科魚的來源、相似度

1.2 色譜條件

采用Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，進行梯度洗脫：0～7 min，38% A；7～15 min，38%～81% A；15～35 min，81%～94% A；35～40 min，94%～100% A。在波長230 nm、進樣量20 μL、柱溫30℃、流速0.6 mL/min條件下進行檢測。

1.3 供試品溶液的制備

將魚體背部肌肉冷凍干燥24 h后，打粉過0.250 mm孔徑（60目）篩；稱取1 g肌肉粉末，用乙酸乙酯定容至50 mL，超聲提取30 min，過濾，濾液水浴60 ℃揮干溶劑，取10 mL乙腈溶解濾渣，超聲萃取20 min，按5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.46 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4 方法學考察

參照以往對HPLC圖譜研究方法，按表2分別進行相關項目。

表2 HPLC指紋考察項目及結果

接表2

2 結果與分析

2.1 指紋圖譜的建立

將記錄好的13批鯉科魚肌肉供試品（溶液）HPLC圖譜以一定格式（AIA）順序導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A版》[9]軟件，以S1號樣品的圖譜為參照圖譜，時間漂移值設定為0.1，選用中位數法自動匹配譜峰，并生成相關圖譜（圖1）。所得圖譜中，以共有的15號色譜峰為參比峰，以其保留時間為1，選擇峰面積較大峰位較居中的圖譜，確定18個共有指紋峰，并對其相對峰面積和相對保留時間進行計算（SRSD值均＜3.0%），符合指紋圖譜的分析要求[10]，見表3和表4。

圖1 試驗鯉科魚的HPLC對照圖譜（A）及疊加特征圖譜（B）

表3 試驗鯉科魚指紋圖譜共有峰相對保留時間

表4 試驗鯉科魚指紋圖譜共有峰相對峰面積

接表4

2.2 相似度評價

以對照圖譜的相似度為1，分別對照樣品HPLC圖譜的相似度（結果見表1）。與對照組圖譜相比，13批鯉魚樣品的相似度在0.861～0.990之間，表明各產地鯉魚品質相對穩定，如圖1疊加HPLC特征圖譜所示，試驗鯉魚的主要組成成分基本相同，但各組成成分在含量上有一定的差異。其中樣品S5，S7和S8（貴州惠水）的相似度比較低，另外9個批次的鯉科魚相似度較高（相似度＞0.9）。

2.3 聚類分析

聚類分析是一種廣泛應用于植物、中藥材、動物鑒別、品種分類和質量評價等方面的研究分析方法[11-12]，通過該方法探討對比試驗樣本之間的相關度及品質差異是常用的研究手段。

從指紋圖譜中共有色譜峰代表分析樣品均含有的化學成分，所在峰面積表示相應的成分含量。試驗采用組間連接法，通過余弦距離計算樣品間距離，在SPSS 19.0軟件中將各樣品共有峰面積作為變量導入，對13批鯉科魚樣品運行系統聚類分析，結果如圖2所示。判別條件距離為25時，試驗所分析的13批鯉科魚樣品被分為兩類，其中S5，S6，S7，S8和S13聚為一類，其余8個產地樣品歸為另一類。因此，采用HPLC指紋圖譜，結合聚類分析和相似度分析可為初步判斷所用鯉科類所屬種類提供參考，但未能區分不同產地的鯉科魚。

圖2 鯉科魚HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積的聚類分析

2.4 主成分分析

2.4.1 主成分因子特征值、方差貢獻率分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗樣品主成分因子分析，結果見表5。以特征值＞1為標準，其中前5個主成分因子的特征值分別為9.025，2.675，2.225，1.287和1.040，方差貢獻率分別為50.141%，14.861%，12.361%，7.152%和5.778%，累積方差貢獻率為90.292%＞90%，說明通過引用前5個主成分即可代表樣品94%以上的信息，證明該組數據有突出的成分可以依據，適用于主成分分析。故通過前5個主成分因子分別對13批鯉魚樣品的共有成分進行評價，詳見表6。由表6可知，主成分因子1可反映成分9，10，11，12，13，14，15，16，17和18的信息，主成分因子2可反映成分1，2，3，4和6的信息，主成分因子3可反映成分2，3和9的信息，主成分因子4可反映成分1，7，8和9的信息，主成分因子5可反映成分4和8的信息。以上述因子作變量繪制載荷圖（圖3）。由圖3可知，載荷圖結果與初始因子載荷矩陣結果相同，距離原點較遠的點為主成分因子1，2，3，4和5中權重值較大的成分。

表5 5個主成分因子的特征值和方差貢獻率

表6 旋轉后的主因子載荷矩陣表

圖3 載荷圖

2.4.2 綜合質量評分

通過5個主成分因子對13批鯉魚樣品進行綜合評分，結果見表7。主成分因子綜合得分（major factor synthesis score，MFSC）中S9號鯉魚樣品（正安縣正南河）最高，該批樣品中1和9～18共11個主成分的含量相對較高，相對而言整體質量較好[13]。

表7 主成分因子得分及排序

3 討論

3.1 提取方法的考察

參照水產品指紋圖譜相關研究，試驗對70%甲醇、甲醇、乙醇等6種提取溶劑進行篩選，得出以乙醇提取的樣品溶液圖譜出峰信息量較大，且基線較為平穩。考察回流和超聲提取2種提取方式，結果表明2種方式得出的色譜圖差異不大，由于回流提取耗時較長、步驟較繁瑣，所以選定超聲方法進行提取；超聲提取方面，考察30 min（超聲1次），50 min（超聲2次，第1次30 min、第2次20 min）以及120 min（超聲4次，每次30 min）3個提取時間，對比得出超聲提取80 min（超聲2次，第1次30 min、第2次20 min）的提取效果圖譜信息更完整。

3.2 色譜條件的優化

試驗通過對比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.01%磷酸這4種流動相洗脫體系，得出以乙腈-0.01%磷酸體系的效果較好（色譜峰的峰形和分離度較好、色譜峰較多）。比較2種高效液相色譜柱Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜圖，結果顯示Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱的分離度和峰形效果較好，圖譜基線較平穩。分別考察柱溫20～35 ℃時對色譜峰分離度的影響，得出柱溫30 ℃時效果較佳。比較流速0.6～1.2 mL/min對色譜圖峰形的影響，結果以0.6 mL/min時的峰形更對稱。對波長210，230，254，280，310和360 nm進行考察，對比得出在230 nm下圖譜中各色譜峰響應值更高，基線較為平穩，整體信息更全面，故選擇230 nm作為檢測波長。

3.3 相似度、聚類分析及主成分分析討論

來源于不同產地的鯉科魚HPLC指紋圖譜有18個共有峰，從結果來看，三者（相似度、得分圖及綜合得分）相互印證，相似度較低的S7樣品（貴州惠水縣養殖的黃河鯉），得分圖中較離群，綜合得分較差，排名靠后。結合得分圖情況，13批鯉科魚主成分有一定差異，同一品種不同產地的樣品魚如S3和S12（野生裂腹魚）存在一定差異，而同一品種在不同產地的樣品魚如S1和S9、S5和S13（中華倒刺鲃、清水江鯉）的品質相似，同一品種、同一地點的樣品魚如S5和S13（清水江鯉）相似度存在差異。這與聚類分析結果有一定差異，原因可能是主成分分析以絕對峰面積為主，而聚類分析主要是以相對峰面積為主。當然，魚類品質的影響因素是多方面的，比如環境、餌料、生長年限等，因此建立水產品特有專屬性和特征性的評價體系是很有必要的。綜合此次試驗聚類分析和主成分分析的結果，結合圖譜峰面積數據，可把這13批鯉科魚分為三類，第一類為S1，S8和S9，第二類為S4，S10，S11和S12，第三類為S2，S3，S5，S6，S7和S13。相對來說此次試驗樣品魚品質質量排序為第一類＞第二類＞第三類。

3.4 鯉科魚指紋圖譜評價

影響水產品品質的因素主要包括種質特性、養殖環境、飼喂餌料及生理狀態[14-15]。鯉科魚類是我國養殖的主要經濟魚類之一，而由于遺傳品種及養殖技術等差異，市場上售賣的鯉科魚的口感和價格差異較大，在此過程中難免出現濫竽充數，將養殖品作為野生品出售的情況，這嚴重影響了市場的合理發展。因此，對于水產品尤其是特色經濟鯉科魚類建立一種可行的方法來判斷區別魚類品質和質量控制很有必要。隨著人類社會對水產品需求量的增大及食品安全意識的加強，水產品品質質量控制越顯重要。結合以往關于有效的食藥品質量控制模式研究，指紋圖譜作為因具有科學的理論依據和實踐累積獲得食品藥品質量控制業界的一致認可[16-17]。指紋圖譜的優勢在于在主成分未明確情況下，仍可以得到可靠充分的含量類別和數量信息，從而控制食藥品質量[18-19]。根據相關文獻[20-25]報道，不同生長環境和養殖方式的水產品在脂肪酸、磷脂等成分含量方面差異明顯，而這些差異在HPLC圖譜中有所體現，這與以往對其他水產品的研究中得出的結果相同。所以，HPLC指紋圖譜可以很好地彌補常規品質質量控制方法的缺陷，應用于水產品的產品質質量控制。

4 結論

試驗根據鯉科魚肌肉中化學組成物質種類和含量差異建立其指紋圖譜，結合相似度分析、聚類分析，為鯉科魚品質質量評價提供參考。在特色經濟鯉科魚的養殖銷售過程中，能較好地區分養殖品質量，規范水產品行業發展。然而，試驗所用的樣品數和產地來源相對較少，具有一定局限性，后續可通過擴大樣本量，收集全國各地不同產地樣品，進一步完善相關試驗因子，從而對鯉科魚的質量進行更全面的評價和控制，更好地為水產業健康發展保駕護航。