葛根姜黃復合物解酒護肝效果

許尨，鄭麗君，馬海然*，李洪亮，胡鵬麗，趙婧茹

1.內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司（呼和浩特 011500）；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司（北京 101100）；3.內蒙古自治區乳品與奶牛繁育生物工程技術企業重點實驗室（呼和浩特 011500）

長期飲酒或是短期內大量飲酒都會造成人體肝臟的損傷甚至是肝臟致病影響，酒精性肝病主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌。隨著生活水平的不斷提升，酒精消費的人群不斷年輕化，對于肝臟的損傷也引起人們的關注度，在有效預防早期酒精性肝病損傷上還缺乏有效治療藥物。

葛根在我國有悠久的使用歷史，葛根為豆科植物野葛、甘葛或粉葛的干燥根，是生活中較常見的藥食兩用資源。《中國藥典2010》中記載，葛根味甘、辛，性涼，歸胃、肺經，有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉等功效[1]。葛根在治療心血管疾病，抗氧化，抗糖尿病，抗腫瘤，對抗神經系統、骨系統疾病的作用，抗炎癥等方面有很好療效，針對功能機理的研究不斷開展[2-3]。姜黃屬于姜科姜黃屬植物姜黃的根莖，我國主要產地為四川、江西、福建等地，主要成分為姜黃類化合物，對姜黃的研究主要在其抗炎癥治療效果上。

針對葛根、姜黃的藥理作用進行研究，試驗將葛根與姜黃按照一定比例進行搭配使用，應用在食品加工中，旨在開發一款具有保肝解酒效果的混合物，并進行動物試驗驗證其效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 測試樣品制備

葛根姜黃復合物內容物組分：以葛根素為指標，葛根素含量控制在15%，以姜黃素為指標，姜黃素含量控制在30%，以檸檬酸、甜味劑、復合維生素為輔助成分。100 g混合物為例，葛根1.3 g、姜黃0.2 g、白砂糖15.0 g、檸檬酸0.3 g、復合維生素0.2 g、水83.0 g。

1.1.2 試驗動物

CD（SD）大鼠140只[北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，SPF級，雌雄各半，質量合格證號1100111911077830，體重180～210 g，生產許可證號SCXK（京）2016-0011]；試驗動物房為屏障系統+IVC籠盒[使用許可證號SYXK（京）2017-0033，溫度20～25 ℃，相對濕度45%～65%]；動物飼料、墊料（均由北京科澳協力飼料有限公司提供）。

1.1.3 主要儀器和試劑

蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；一次性注射器（江蘇正康醫療器械有限公司）；灌胃針（上海起發實驗試劑有限公司）；電子天平（梅特勒托利多）；超凈工作臺（廣州靈潔空氣凈化設備制造有限公司）；氯胺酮戊和巴比妥鈉[西寶生物科技（上海）股份有限公司]；紅星二鍋頭（53%，北京紅星股份有限公司）；無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）；高效切片石蠟（上海華永石蠟有限公司）；蘇木素-伊紅染液、載玻片（武漢賽維爾生物科技有限公司）；藤茶、力克、姜黃之力（市售）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鼠酒精耐受試驗（表1）

表1 酒精耐受測試試驗

取大鼠若干只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，試驗前禁食1夜（12 h）。各組分別用白酒5，7，10，15和20 mL/kg體重灌服，觀察大鼠活動及死亡情況，重復3次，記錄內大鼠的死亡只數。

1.2.2 大鼠防醉酒試驗

將大鼠隨機分為生理鹽水、試驗低劑量組、試驗高劑量組、陽性對照組1（藤茶組）、陽性對照組2（力克）、陽性對照組3（姜黃之力），每組20只。根據試驗確定大鼠酒精耐受量，確定灌酒量、灌藥量如表2所示。灌藥30 min后，各組均灌胃白酒，每只灌酒量為確定的醉酒量。每只大鼠灌胃結束，把大鼠進行顛倒放置，即四肢朝上、背部朝下，觀察其翻正反射的情況。醉酒判定標準：翻正反射消失并且持續30 s，為醉酒，記錄翻正消失的時間稱為耐受時間。

表2 樣品防醉測試試驗

1.2.3 大鼠酒精代謝解酒試驗

將大鼠隨機分為生理鹽水、試驗低劑量組、試驗高劑量組、陽性對照組1、陽性對照組2、陽性對照組3，每組20只。根據試驗確定大鼠酒精耐受量，確定灌酒量，灌藥量如表3所示。各組灌藥30 min后，均灌胃白酒，每只灌酒量為確定的醉酒量。觀察大鼠活動情況，以大鼠后腹拖地、爬行不穩、閉眼懶動等為睡眠（醉酒）指標，以四肢靈活、行動自如、精神恢復為蘇醒（醒酒）指標。記錄大鼠入睡醉酒時間和蘇醒醒酒時間。

表3 樣品解酒測試試驗

1.2.4 酒精性肝損傷試驗

1.2.4.1 肝損傷模型

取140只SD大鼠，隨機分成7組，每組20只，雌雄各半，分別為生理鹽水、試驗低劑量組、試驗高劑量組、陽性對照組1、陽性對照組2、陽性對照組3及空白對照組。每天每組分別用樣品灌胃（劑量如表4所示），30 min后均以0.07 mL/10 g體重白酒灌胃，連續不間斷灌胃30 d。

表4 樣品肝損傷測試試驗

1.2.4.2 丙氨酸氨基轉移酶測定

從大鼠頸動脈取血，采用IFCC推薦法，測定血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT，谷丙轉氨酶）含量。

1.2.4.3 肝臟病理學切片觀察

將大鼠解剖，取出部分肝臟，采用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，間斷連續切片，切片厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察。

顯微鏡下仔細觀察每張組織切片并記錄組織學變化。組織病變程度采用五級分法：無病變或極少量病變計分為0，標注-；有輕度病變或少量病變計分為1，標注+；有中度病變或中等量病變計分為2，標注++；有重度病變或多量病變計分為3，標注+++；有極重度病變或大量病變計分為4，標注++++。

2 結果與分析

2.1 大鼠酒精耐受試驗

對大鼠進行不同酒精梯度灌胃試驗，結果顯示如表5。酒精量超過10 mL/kg出現半數致死量，大鼠不耐受，大鼠灌胃控制在5 mL/kg時，雖然全部存活，但存在未酒醉現象，而控制酒精量在7 mL/kg時，大鼠基本全部存活，同時出現醉酒現象，大鼠爬行不穩、后腹拖地、毛松散、閉眼不動。

表5 灌酒后大鼠存活數 單位：只

2.2 大鼠防醉酒試驗

從表6可見：與空白組相比，試驗組低、高劑量組能顯著提升大鼠的耐受時間，延長大鼠的醉酒潛伏期。進一步分析比較發現，試驗低、高劑量組耐受時間比陽性對照組1，2和3效果明顯，試驗高劑量組比陽性對照組1，2和3耐受時間提高113.6%，148.6%和132.2%，結果表明葛根和姜黃復合物可提升大鼠酒精耐受程度，延緩醉酒時間。這主要是葛根中的主要功能成分葛根素延緩胃排空時間，減緩酒精的吸收速度，降低腸壁的通透性，減少胃黏膜的滲透性，酒精進入血液時間延長，從而減少對神經系統的刺激和損傷[4-6]。

表6 大鼠酒精耐受時間

2.3 大鼠酒精代謝解酒試驗

從表7可見：與生理鹽水組相比，試驗組低、高劑量組能顯著縮短大鼠的醉酒時間和蘇醒時間。進一步分析比較發現，高劑量組醉酒時間比生理鹽水組降低23.6%，入睡大鼠數量減少，醒酒效果顯著，與對照組1，2和3相比，高劑量組效果顯著優于所有對照組。結果表明葛根和姜黃復合物可延長醉酒潛伏期，顯著縮短醒酒時間，減少大鼠入睡數量。這可能是因為葛根素在酒精代謝途徑中提高乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶的活性，加速酒精代謝，同時抑制線粒體中細胞色素P450的活性，減少活性氧的產生[7-10]。

表7 復合物對酒精代謝的影響

2.4 酒精性肝損傷試驗

2.4.1 丙氨酸氨基轉移酶測定

血清中ALT和AST活性是醫學臨床上通過生化法檢查肝功能的常規指標，用于判斷肝臟是否受到損害。血清AST和ALT活性升高，AST/ALT＞2，平紅細胞容積（MCV）升高等是酒精性肝病的特征臨床診斷指標。

由圖1可知，與空白組相比，酒精可導致生理鹽水組大鼠血清中ALT活性升高，存在顯著性差異。與生理鹽水組相比，各試驗組、陽性組2和3可有效降低ALT活性，甚至降低至空白組以下，試驗組高低劑量組顯著低于空白組，表明試驗組可能具有較好的護肝效果。

圖1 丙氨酸氨基轉移酶含量

2.4.2 肝切片

試驗組HE切片統計結果見表8。

表8 HE切片診斷結果

在光鏡下觀察肝組織HE切片發現，空白組大鼠（見圖2）肝小葉結構整齊，以中央靜脈為中心肝板組織肝小葉結構清晰，胞質疏松淡染，未見明顯炎性細胞浸潤。生理鹽水組（見圖3）組織局部可見膠原纖維橋接形成（黑色箭頭），局部匯管區可見較多炎性細胞灶狀浸潤（虛線箭頭）。試驗低劑量組（見圖4）組織肝小葉結構清晰，可見少量肝細胞輕度顆粒變性（粗箭頭），胞質疏松淡染，可見少量肝細胞脂肪變性（黑色箭頭），胞質中含有大小不一的脂肪空泡，未見明顯炎性細胞浸潤。試驗高劑量組（見圖5）組織可見個別肝細胞脂肪變性（黑色箭頭），胞質中含有大小不一的脂肪空泡，局部肝小葉中偶見炎性細胞浸潤小灶（虛線箭頭），局部匯管區周圍可見膽管細胞增生（粗箭頭）。陽性對照組1（見圖6）組織可見較多肝細胞輕中度顆粒變性（黑色箭頭），胞質疏松淡染，局部靜脈周圍可見纖維橋接形成（粗箭頭），未見明顯炎性細胞浸潤。陽性對照組2（見圖7）組織可見大量肝細胞中度顆粒變性（黑色箭頭），胞質疏松淡染，匯管區可見膽管細胞和纖維細胞增生，局部可見肝細胞壞死灶（粗箭頭），胞核消失、碎裂，胞質嗜酸性增強，肝小葉中可見少量炎性細胞浸潤小灶（虛線箭頭）。陽性對照組3（見圖8）組織肝小葉結構清晰，局部靜脈周圍偶見炎性細胞浸潤（虛線箭頭），局部匯管區膽管細胞增生，伴膠原纖維增生（黑色箭頭）。

圖2 空白組（a）和空白組（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖3 生理鹽水組（a）和生理鹽水組（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖4 試驗低劑量組（a）和試驗低劑量組（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖5 試驗高劑量組（a）和試驗高劑量組（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖6 陽性對照組1（a）和陽性對照組1（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖7 陽性對照組2（a）和陽性對照組2（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖8 陽性對照組3（a）和陽性對照組3（b）大鼠肝組織切片HE×20

研究表明，高低劑量的葛根素均能有效緩解慢性酒精攝入和加速酒精代謝。酒精攝入可獨立促進肝脂肪變性的發展，進而發展為纖維化和肝硬化。相比以姜黃素和二氫楊梅素為主要功效成分的陽性對照組來說，葛根與姜黃復合物在預防酒精性肝損傷和加速酒精代謝上有顯著效果，可能原因是葛根素和姜黃素在干細胞酒精代謝通路上提升乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶的活性，同時抑制CYP2E1的活性，減少細胞中的活性氧產生，降低對細胞的脂質過氧化損傷[11-14]。

3 結論

試驗通過灌胃確認大鼠酒精的耐受度并開展各試驗組及對照組，試驗發現高劑量組能顯著提升大鼠的耐受時間，延長大鼠的醉酒潛伏期，葛根和姜黃復合物可顯著縮短醒酒時間，減少大鼠入睡數量，復合物可有效抑制丙氨酸氨基轉移酶活性，減輕肝細胞變性、腫脹，減少脂肪滴含量，有較好的護肝作用。葛根姜黃作為常用的藥食同源的食品原料，其中的功能成分和作用機理仍需要深度研究，多靶點、多成分的特點可廣泛應用在食品加工中，滿足市場對功能性食品的需求。