牛蛙背部腫脹病的病原菌分離與鑒定及藥敏實驗

梁延達，楊美玲，徐 斌，黃俊旗，于 輝，楊 映

(1．佛山科學技術學院 ，廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室，廣東佛山 528231;2．佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東佛山 528231;3．廣東海興農集團有限公司，廣州 511400)

牛蛙(Ranacatesbeiana)原產于北美洲地區，在上世紀50年代從古巴引入中國養殖，屬于兩棲綱(Amphibian)無尾目(Anura)新蛙亞目(Neobatrachia)蛙科(Ranidae)[1]。在我國牛蛙的養殖分布在全國各地，2020年淡水養殖蛙產量137 999 t，增長幅度為28.55%[2]。牛蛙肉質鮮美，營養豐富，富含銅、鋅、錳和鐵等多種微量元素，其肌肉脂肪含量僅有2.1%，而蛋白質含量高達18.90%，深受消費者的青睞[3]。養殖牛蛙易發生多種病害 ，如布韋不動桿菌(Acinetobacterbouvetii)和變形桿菌(Proteus)導致的腐皮病[4-5]，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)導致的紅腿病[6]，淺黃假單胞菌(P.luteola)導致的歪頭病[7],洛菲不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)導致的腹水病[8]等。在病害治療期間，由于養殖戶沒有針對性地使用抗生素，導致病原出現耐藥性。

2021年9月廣東番禺某牛蛙養殖場爆發疾病，發病蛙表現為精神不濟、行動遲緩、食欲不振且背部和腹部出現腫脹，隨著病情加重，背部皮膚因積液過多發生破裂，最終死亡。本實驗室從牛蛙養殖場用保溫箱帶回5只具有相同癥狀且瀕臨死亡的牛蛙，解剖發現其背部、肝臟、脾臟腫大，腹腔中出現血紅色的積液，從病變部位進行細菌的分離純化出優勢菌，并通過革蘭氏染色、16S rRNA基因擴增測序、進化樹構建、生化鑒定和人工感染回歸實驗等方法對細菌進行鑒定，進行細菌藥敏實驗確定其對于各種抗生素的敏感性。期望能明確該病的致病原因，為牛蛙細菌性疾病的預防和治療提供方向和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在廣東番禺某養殖場采集5只瀕死的牛蛙，均質量為(150.0 ± 1.0)g，加上冰袋裝進泡沫箱帶回實驗室。健康蛙均重為(160.0 ± 3.0)g，與患病蛙取自同一養殖場，在實驗室水箱中暫養7 d，暫養水溫在(28 ± 1)℃，每日投喂兩次，喂食量為體重的1%，未見任何發病狀況。在人工回歸感染實驗之前隨機抽取三只健康蛙解剖觀察，并取其內臟組織涂板于BHI營養瓊脂上進行細菌檢測，確定是否有感染病原菌。

SuperMix溶液、核酸染料和DNA Marker購于北京全式金生物技術有限公司；營養肉湯培養基和微量生化鑒定管購于青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司； 藥敏片購于杭州微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌的分離和培養

無菌操作取病蛙的肝臟、脾臟和背部積液，接種于普通營養瓊脂平板上，置于恒溫培養生化箱37 ℃下培養24 h后，選取優勢菌落進行重復劃線純化，得到形態大小一致的兩種純菌落，分別為GPY923和GPX924。然后取純化菌株用普通營養肉湯在37 ℃的氣浴恒溫搖床培養16 h，每種分裝10只2 mL的EP管中加入甘油進行保種，放在- 20 ℃冰箱備用。

1.3 16S rRNA與系統發育樹分析

使用裂解法提取兩種細菌的總DNA作為模板，采用16S rRNA的引物進行PCR擴增，PCR反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 90 s，35個循環，72 ℃ 終延伸5 min；PCR反應體系：14 μL 2x Easy Taq Super Mix ，1 μL 10 mmol/L正向和反向引物，2 μL模板DNA，ddH2O 32 μL共50 μL。16S rRNA的引物序列如下，F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。陰性對照將細菌模板替換成無菌水。擴增產物經電泳和凝膠成像系統后在1 500 bp位置得到目的條帶后，送去上海生工測序。

1.4 革蘭氏染色及生理生化特性鑒定

將之前備用的純化細菌涂在BHI平板上，在生化培養箱37 ℃重新培養18 h后觀察菌落形態，再選取單個菌落進行革蘭氏染色，染色完畢后用光學顯微鏡觀察菌體形態及顏色，判斷細菌屬性。然后將平板上的單菌落按照說明書要求進行生化鑒定。

1.5 人工回歸感染實驗

將40只健康牛蛙隨機分為4組，3個實驗組(GPY923細菌感染組、GPX924細菌感染組、GPY923和GPX924混合細菌感染組。) ，1個對照組。實驗組注射病原菌的無菌PBS緩沖液重懸液，濃度為1.0×108cfu/mL,每只注射劑量為0.3 mL，對照組注射等量無菌PBS緩沖液，均在背部的肌肉進行注射。注射后連續14 d觀察并記錄牛蛙的死亡數量、死亡時間，并對瀕死的蛙進行細菌分離鑒定。

1.6 肝臟切片觀察

分別取瀕死牛蛙的肝、脾和潰爛的皮膚與健康牛蛙的肝、脾和皮膚，固定于多聚甲醛固定液常溫固定24 h，制作石蠟切片，經蘇木精—伊紅法染色后用光學顯微鏡觀察。

1.7 藥物敏感實驗

將兩種細菌用比濁法調濃度至1.0×108cfu/mL的病原菌涂布于BHI平板上，然后用無菌的鑷子將林可霉素、丁胺卡那、紅霉素、氯霉素、多西環素、恩諾沙星、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢氨芐、卡那霉素、阿奇霉素、氨芐西林、青霉素、環丙沙星、新霉素、羧芐西林、氟苯尼考、阿莫西林、四環素、利福平、慶大霉素、磺胺異噁唑、苯唑西林和麥迪霉素共24種不同的藥敏片貼附于平板上，37 ℃培養24 h后測量并記錄抑菌環的直徑。根據說明書推薦的判斷標準判斷細菌對于藥物的敏感程度。每種藥敏片重復操作3次。

2 實驗結果

2.1 發病牛蛙的臨床癥狀

自然發病牛蛙初期(圖1-a)和中期(圖1-b)出現背部隆起和背部出血的癥狀，隨著背部的積液增多，皮膚逐漸變薄，最終破裂(圖1-c)。在這期間，牛蛙食欲不振，神情呆滯，行動緩慢，體色變黑。解剖死蛙發現其肝臟出現花斑且呈棕色，脾臟腫大變黑，膽囊發黑，腹部出現紅色的積液且肌肉出現出血的現象(圖1-d)。

圖1 自然發病牛蛙感染初、中、末期及解剖圖

2.2 16S rRNA基因序列分析

將測序結果在NCBI的GenBank中進行Blast比對，初步鑒定菌株GPY923為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，菌株GPY924為海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)，然后用MEGA10的N-J法構建系統發育樹。兩株細菌的系統進化樹構建結果如圖2與圖3所示，菌株GPY923與嗜水氣單胞菌、GPY924與海豚鏈球菌親緣關系最近，聚在同一枝上，置信度分別為97%和100%。

圖2 菌株GPY923系統進化樹構建結果

圖3 菌株GPY924系統進化樹構建結果

2.3 革蘭氏染色與生理生化特性結果

從患病牛蛙的背部積液、肝、脾的部位分離純化出兩株細菌，革蘭氏染色后用光學顯微鏡進行觀察，GPY923為革蘭氏陰性短桿菌，GPX924為革蘭氏陽性球菌(如圖4和圖5所示)。在普通營養瓊脂上培養24 h后觀察到，GPY923菌落為中央凸起圓形，顏色呈灰白色；GPX924菌落則為短鏈狀白色小圓點。再將兩株細菌接種在血瓊脂平板上，菌落周圍均出現透明的溶血環，為β型溶血。根據分離的兩株細菌的形態顏色及生理生化特性結果，結合《常見細菌系統鑒定手冊》[9]和《伯杰氏系統細菌學手冊》[10]判斷菌株GPY923為嗜水氣單胞菌，GPX924為海豚鏈球菌。分離菌株的生理生化鑒定結果如表1所示。

圖4 GPY923革蘭氏染色結果

圖5 GPY924革蘭氏染色結果

表1 分離菌株的生理生化鑒定結果

2.4 組織病理學觀察

組織病理學觀察結果顯示，所有病蛙的肝臟中均出現肝細胞局灶性裂解壞死現象，圖6-g壞死程度最大，圖6-a和圖6-d部分出現黑色素巨噬細胞。病蛙的脾臟出現不同程度炎癥細胞浸潤和紅髓細胞間隙增寬現象，部分細胞出現核固縮，圖6-b中細胞裂解壞死殘存細胞碎片。圖6-c、 圖6-f和圖6-i的皮膚纖維細胞均有損傷，圖6-c和圖6-i的纖維細胞結構排列疏松，出現斷裂，真皮層下的組織也發生斷裂。

圖6 人工感染牛蛙組織學觀察

2.5 人工回歸感染實驗結果

3個實驗組在感染的第3 d后，出現精神萎靡，食欲不振，背部注射部位腫脹的現象，而對照組正常。第7 d，混合細菌感染組的背部腫脹程度比其他兩個實驗組更嚴重，其背部皮膚變薄，出現了死亡現象。第14 d，混合細菌感染組只剩下兩只瀕死牛蛙；GPY923細菌感染組和GPX924細菌感染組死亡數均為6只，其余牛蛙狀態萎靡。16 d后實驗組牛蛙均死亡。對照組狀態正常，未出現死亡。將瀕死牛蛙解剖觀察，GPY923和GPX924混合細菌感染組與自然感染的特征一致；而GPY923細菌感染組背部腫脹程度小于GPX924細菌感染組，其內部器官亦呈現出不同程度的充血和出血現象。

2.6 藥物敏感實驗結果

結果如表2中所示,菌株GPY923對丁胺卡那、頭孢他啶、頭孢呋辛、青霉素和氟苯尼考敏感，對紅霉素、多西環素、頭孢氨芐、卡那霉素和新霉素中度敏感，對林可霉素、氯霉素、恩諾沙星、阿奇霉素、氨芐西林、環丙沙星、羧芐西林、阿莫西林、四環素、利福平、慶大霉素、磺胺異噁唑、苯唑西林和麥迪霉素不敏感。菌株GPY924對丁胺卡那、紅霉素、氯霉素、多西環素、恩諾沙星、頭孢氨芐、卡那霉素、阿奇霉素、氨芐西林、青霉素、環丙沙星、新霉素、羧芐西林、氟苯尼考、阿莫西林、四環素、利福平、慶大霉素、磺胺異噁唑、苯唑西林和麥迪霉素敏感，對頭孢他啶中度敏感，對林可霉素和頭孢呋辛不敏感。

表2 牛蛙分離菌的藥物敏感性試驗

3 討論

嗜水氣單胞菌屬于革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于水體環境中，能感染多種生活在水體環境的動物，包括草魚(Ctenopharyngodonidella)、羅非魚(Oreochromismossambicus)、黃鱔(Monopterusalbus)和中華鱉(Pelodiscussinensis)等[13-16]。感染動物主要特征為局部皮膚發生潰爛和肌肉或內臟充血出血,本試驗的人工感染試驗患病牛蛙癥狀與之一致。本研究中嗜水氣單胞菌接種在血瓊脂平板時產生β型溶血環證明其有較強的溶血性，推測其原因為分離出的嗜水氣單胞菌能產生外毒素中的溶血素導致動物內出血[17]。海豚鏈球菌為革蘭氏陽性球菌，感染動物包括羅非魚和鱘(Acipensersinensis)等[18-19],感染的臨床癥狀為肝、脾、腎腫脹出血，體表出血潰瘍，海豚感染則表現為皮膚膿腫[20]。海豚鏈球菌感染其它物種的典型特征與本研究中患病牛蛙相符，其部分不同特征產生的原因推測可能是物種的差異性導致的。海豚鏈球菌在溶血試驗中出現β型溶血環，證明此致病菌有較強的溶血性。廣東南部地區夏秋季的水溫偏高，普遍在25 ℃以上，非常適宜嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌的快速繁殖，并且牛蛙的養殖模式為高密度養殖，在攝食斗爭或求偶時容易導致體表損傷繼而引發感染。有學者研究表明[21]嗜水氣單胞菌是抑制蛙類的自身免疫力的重要因素，當牛蛙感染了嗜水氣單胞菌后，自身免疫力下降，使其更容易感染海豚鏈球菌。海豚鏈球菌則在牛蛙的背部產生膿腫，加重牛蛙的病情，使牛蛙加速走向死亡。海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌都有較強的溶血性，兩者協同使牛蛙死于敗血癥。

本研究中患病牛蛙在背部出現腫脹癥狀，在牛蛙常見的腐皮病、腹水病、紅腿病和消化道疾病中尚未發現此癥狀。本試驗藥敏試驗結果表明嗜水氣單胞菌對丁胺卡那、頭孢他啶、頭孢呋辛、青霉素和氟苯尼考敏感，對多種藥物耐藥；海豚鏈球菌對林可霉素和頭孢呋辛耐藥，對頭孢他啶中度敏感，其余藥物均敏感。嗜水氣單胞菌的藥敏實驗中使用了24種抗生素只有6種抗生素為敏感，接近3/4的抗生素耐藥。嗜水氣單胞菌的耐藥程度非常高，其可能與人們長期濫用和盲目使用抗生素有關。為了避免以后無藥可用的情況發生，學者們需極力尋找抗生素的替代品。有研究表明中草藥能有效防治細菌性疾病，并減少環境的污染，如訶子和秦皮能抑制和殺死嗜水氣單胞菌，抑菌環直徑達到20 mm以上[22]。黃連和黃柏等藥物對抑制海豚鏈球菌較強[23]。

綜上所述，本實驗確定海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌為牛蛙患病的主要病原，綜合感染后可導致牛蛙背部腫脹，多個器官病理損傷，最后因嚴重的出血和功能障礙死亡。其中的嗜水氣單胞菌對多種抗生素產生耐藥性，對頭孢類藥物敏感；但海豚鏈球菌對頭孢類藥物有耐藥性，綜合兩者特性，在藥物的選擇上要使用丁胺卡那、紅霉素和氟苯尼考等抗生素或使用中草藥進行抑菌殺菌。