干旱脅迫對大鱗副泥鰍免疫指標的影響

黃 梅，吳夢曉，商澤昊，尤 昆，米 笛，王光毅，張云龍

(安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036)

環境脅迫會打破水生動物與環境之間的平衡與協調，影響機體正常的生理生化和免疫功能，導致水生動物生長減慢[1]、免疫抑制[2]、氧化應激[3,4]和細胞凋亡[5]等生理損傷，甚至可能會對水生動物產生致死性的傷害。免疫系統是魚類維持機體平衡的重要防御機制，由于魚類的特異性免疫系統還不完善，所以當受到外界應激源的刺激時，魚體組織常會分泌抗菌蛋白(如溶菌酶、補體蛋白)、抗體(如免疫球蛋白)、免疫細胞因子(如腫瘤壞死因子、白細胞介素)和熱休克蛋白等非特異性免疫因子，以減輕應激造成的機體損害[6]。

魚類在現代集約化養殖、拉網和運輸過程中常受到各種理化應激，對多數魚類而言，空氣暴露是一種極端的干旱環境脅迫。然而，泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[7]、黃鱔(Monopterusalbus)[8]和大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[9]等氣呼吸型魚類常養殖于水量較少的稻田中，易遭遇周期性干旱[10]；在成魚捕撈過程中，養殖戶常采用排干池水的方法捕撈。此外，為了降低成本，商業化的氣呼吸型魚類在短途運輸中廣泛采用半干法，僅潑灑少量水保持皮膚濕潤，這些都意味著氣呼吸型魚類經常會遭遇干旱脅迫。作為一種環境因子，干旱會對魚類先天免疫系統造成影響，并增加機體對病原的易感性；以往關于魚類在干旱條件下的研究大多集中在抗氧化方面[11-13]；關于免疫反應，特別是免疫相關指標的變化方面的研究仍然十分匱乏。

大鱗副泥鰍(P.dabryanus)是東亞地區重要的水產養殖品種之一。據《2021中國漁業統計年鑒》統計，2020年我國泥鰍(包括泥鰍和大鱗副泥鰍)的養殖產量達36.74萬噸[14]。作為一種典型的氣呼吸型魚類，大鱗副泥鰍除了可以用鰓呼吸以外，還能在缺氧條件下通過皮膚和腸道進行呼吸，因此比其他魚類具備更高的耐旱能力[15]。魚類，特別是氣呼吸型魚類在養殖與運輸過程中常不可避免會遭遇短時干旱脅迫，但干旱條件下的魚類的生理機理和免疫反應仍知之甚少。本研究以空氣暴露模擬大鱗副泥鰍所經歷的干旱脅迫，檢測其血清與肝臟免疫因子的變化趨勢，旨在研究干旱脅迫對魚類免疫相關因子的影響與適應機制，為魚類無水運輸和養殖策略提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 實驗魚類與材料

實驗用大鱗副泥鰍[(20.1±3.2) g，(15.3±2.9) cm)]購于合肥的水產市場。實驗開始前將魚轉移至實驗室中，暫養于5個60 L的養殖箱中，每個暫養箱盛水50 L，養殖30～50尾，放置3個充氣石。養殖用水是經過曝氣24 h以上的自來水，水溫保持在(23.0±1.0) ℃。在暫養7 d期間，每日換水30%，投喂2次配合飼料(粗蛋白35%，粗脂肪7%)。實驗前24 h停止投喂，且實驗期間不投喂。

總蛋白(TP)測定試劑盒(A045-2-2)、白蛋白(ALB)測定試劑盒(A028-1-1)、溶菌酶(LZM)測試盒(A050-1-1)、免疫球蛋白M(IgM)測試盒(H109-1-1)、補體C3測試盒(H186-1-2)、補體C4測試盒(H186-2-2)、熱休克蛋白70(HSP70)測試盒(H264-2)、熱休克蛋白90(HSP90)測試盒(H264-3)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測試盒(H052-1)、白介素-1β(IL-1β)測試盒(H002)、白介素-6(IL-6)測試盒(H007-1-1)、白介素-12(IL-12)測試盒(H010)，均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 空氣暴露實驗

隨機挑選4尾規格相近的魚放置于圓形塑料盆(直徑35.5 cm，高度15.5 cm)中，盆中加一層很薄的蒸餾水(100 mL)，保持室內溫度(25.0±1.0) ℃(空調控溫)，實驗時間為12、24、48、72和96 h。盆中的蒸餾水每8 h完全更換一次，以確保整個暴露期間的恒定濕度。以實驗開始時的魚(0 h)作為基礎水平的指標，以養殖在10 L曝氣自來水中的魚作為對照組。每個組(空氣暴露組和對照組)每個暴露時間點各設置3組平行，每個平行4尾實驗魚，共72尾。

1.3 樣品采集

每個暴露時間(12、24、48、72和96 h)結束后進行樣品采集，使用MS-222對實驗魚進行麻醉，并通過尾靜脈迅速取血，然后在4 ℃下，4 000g下離心30 min，以收集血清。解剖收集肝臟，以玻璃勻漿器勻漿后，按照體積質量比9 ∶1加入預冷(4 ℃)的生理鹽水，并在4 ℃下，10 000g離心20 min，得到上清液用于后續的生化分析。所有樣品均由平行組的4尾實驗魚合并而來，并保存于-80 ℃的冰箱中待測。

1.4 生化分析

根據ROBINSON等[16]的方法，使用牛血清白蛋白作為標準品，對血清中的總蛋白含量進行定量。以牛血清白蛋白作為標準品，采用考馬斯亮藍法測定肝臟樣品中的可溶性蛋白含量[17]。通過溴甲酚綠方法測定血清白蛋白水平[18]。血清球蛋白濃度按下式計算:球蛋白=總蛋白-白蛋白。溶菌酶活性[19]通過比濁法測定。免疫球蛋白M(IgM)、補體C3(C3)、補體C4(C4)、熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白90(HSP90)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素12(IL-12)通過酶聯免疫吸附(ELISA)方法測定。

1.5 數據分析

所有數據均以平均值±標準誤表示。先進行正態性和Levene′s方差同質性檢驗，隨后進行單因素方差分析(ANOVA)和LSD多重比較檢測結果的顯著性水平，顯著性水平α=0.05。t檢驗分析比較同一時間的空氣暴露和對照之間的差異顯著性。使用SPSS軟件(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)進行統計分析。

2 結果

空氣暴露后大鱗副泥鰍血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量都呈先增后降的趨勢，并均在暴露48 h時達到峰值(圖1)。血清白蛋白含量增加速度較快，暴露24 h和48 h時顯著高于對照組(圖1B)。血清總蛋白(圖1A)和球蛋白(圖1C)含量在48 h顯著高于對照組。血清IgM實驗期間始終與對照組差異不顯著(圖1D)。

圖1 空氣暴露對大鱗副泥鰍血清總蛋白(A)、白蛋白(B)、球蛋白(C)和免疫球蛋白M(D)含量的影響

空氣暴露對大鱗副泥鰍血清與肝臟溶菌酶活性、IgM、補體C3和C4含量的影響見圖2、圖3。實驗期間血清與肝臟溶菌酶活性均無顯著性變化(圖2A，圖3A)。血清C3和C4含量于暴露48 h時達到峰值；其中，補體C3變化幅度較小，與對照組始終差異不顯著(圖2B)。與補體C3相比，C4增殖速度更快，48 h與對照組差異顯著(圖2C)。與對照組相比，空氣暴露12 h肝臟中IgM、C3和C4含量就出現了顯著的上升，并在24 h迅速下降。在整個暴露期間，肝臟與血清當中補體C3和C4含量的變化呈相反的趨勢，當肝臟補體C3和C4在實驗48 h達到最低值時，血清中的補體C3和C4上升至最高值。

圖2 空氣暴露對大鱗副泥鰍血清總溶菌酶(A)活性、補體C3(B)和補體C4(C)含量的影響

圖3 空氣暴露對大鱗副泥鰍肝臟溶菌酶(A)活性、IgM(B)、補體C3(C)和補體C4(D)含量的影響

比較空氣暴露后大鱗副泥鰍血清和肝臟HSP70和HSP90含量的變化(圖4、圖5)。空氣暴露48 h，血清HSP70和HSP90顯著升高到最大值，分別達到基礎水平的3.3倍和2.0倍。48 h后兩者都開始下降，但血清HSP70回歸速度較HSP90慢。相較于血清，大鱗副泥鰍肝臟HSP70和HSP90含量變化更加迅速，僅空氣暴露12 h就達到了峰值，且顯著高于對照組。在實驗中后期(24～96 h)，血清HSP70和HSP90呈高于對照組的趨勢，而肝臟HSP70和HSP90則低于對照組。

圖4 空氣暴露對大鱗副泥鰍血清HSP70(A)和HSP90(B)含量的影響

圖5 不同空氣暴露時間對大鱗副泥鰍肝臟HSP70(A)和HSP90(B)含量的影響

大鱗副泥鰍血清和肝臟中TNF-α、IL-1β、IL-6、和IL-12含量受空氣暴露的影響見圖6和圖7。所有測定的血清炎癥細胞因子都呈現相似的變化模式，先顯著升高后降低，所有峰值均出現在空氣暴露48 h，并且明顯高于對照組(IL-1β除外)。實驗結束時炎癥細胞因子指標均已回歸至正常水平。空氣暴露12 h，肝臟炎癥細胞因子達到峰值，TNF-α和IL-1β增加至基礎水平的1.4倍；IL-6和IL-12增加至基礎水平的1.5倍，均顯著高于對照組(圖7)。

圖6 空氣暴露對大鱗副泥鰍血清TNF-α(A)、IL-1β(B)、IL-6(C)、和IL-12(D)含量的影響

圖7 不同時期空氣暴露對大鱗副泥鰍肝臟TNF-α(A)、IL-1β(B)、IL-6(C)和IL-12(D)含量的影響

3 討論

血清生化參數是評估魚類機體健康狀況的常用指標[4]，當水產動物受到惡劣環境因子脅迫時，血清生化參數通常會出現不同程度的波動。暴露于火電廠廢水中的翠鱧(Channapunctatus)，其血清總蛋白和白蛋白含量出現急劇增加，但球蛋白含量減少[20]。經過銅和鎳處理后的鯉(Cyprinuscarpio)血清總蛋白和球蛋白含量顯著增加，血清白蛋白則有所下降[21]。本研究中，空氣暴露條件下大鱗副泥鰍血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量顯著增加。其中，球蛋白水平的顯著上升可能是大鱗副泥鰍為了減輕機體在應激條件下的病原易感性而做出的免疫調節策略。然而，腹腔注射醋酸銨會顯著降低鯽(Carassiusauratus)[9]和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[4]血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量。這種結果的差異可能是由于實驗設計不同而造成的，魚類普遍難以耐受高氨毒性，醋酸銨導致的嚴重氨中毒使得魚體免疫系統調節失衡，進一步導致了免疫蛋白的減產；而短時間的空氣暴露則激發了大鱗副泥鰍的免疫應答，誘導了相關蛋白的增殖。除此之外，實驗期間，黃顙魚每天投喂兩次而大鱗副泥鰍在此期間不投喂，對能量的需求大大高于黃顙魚；由于魚類在受到環境應激時的能量需求增加，大鱗副泥鰍白蛋白和總蛋白含量增加也可能是作為干旱脅迫期間的能量來源。

當受到抗原刺激時，硬骨魚B細胞會釋放出大量IgM，并通過激活補體系統，發揮溶菌、殺菌及中和病毒等免疫作用[22]。CUESTA等[23]對大西洋鯛(Sparusaurata)進行短時間(2 min)的空氣暴露后血清IgM水平無顯著影響；但隨著脅迫持續至6 h時，大西洋鯛鰓、腸道和皮膚組織中IgM水平均出現顯著增加[24]。肝臟是魚類蛋白質代謝和免疫因子合成的重要器官，大鱗副泥鰍肝臟中IgM含量在實驗的第一個時間段(12 h)就出現了顯著性增加；但在下一時間段(24 h)就迅速下降至基礎水平；上述大西洋鯛多個組織的IgM水平同樣在空氣暴露24 h出現驟降[24]。IgM水平的急劇增減和其特性有關，作為機體接觸外源性抗原后產生的第一抗體，IgM通常在應激的早期就會出現大量累積；但由于半衰期短，所以在體內維持時間短，消失快。

溶菌酶能夠破壞革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖層，從而溶解入侵的致病菌；除此之外其還具有增強補體活性、強化免疫應答、抗腫瘤等作用，廣泛參與了各種防御機制[24]。在空氣暴露期間，大鱗副泥鰍血清和肝臟中溶菌酶活性并無明顯變化。沈凡等[25]的研究表明低氧脅迫下黃顙魚血清溶菌酶活力變化也不顯著。而虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和大西洋鯛在經歷同樣的干旱脅迫后皮膚表面溶菌酶卻有顯著上升的現象[23]。這可能是溶菌酶在魚體組織中的差異性分布造成的，作為魚類先天性免疫系統的第一道防線，溶菌酶主要分布在魚類體表黏液和腎臟中，而血清和肝臟中溶菌酶含量較少[26,27]。另外，本實驗中其他免疫因子的協同作用也可能是大鱗副泥鰍溶菌酶無顯著變化的原因。急性干旱脅迫已被證明對大西洋鯛和斑馬魚(Daniorerio)肝臟的先天免疫因子的激活具有刺激作用，能夠使補體蛋白水平增加[28]。補體是魚類先天性免疫中的輔助系統，活化后具有酶活性、可介導免疫應答和炎癥反應。空氣暴露后，大鱗副泥鰍血清中的補體含量達到峰值時，肝臟補體達到最低值。肝臟補體含量的下降或是因為體液循環將其運輸到血液和其他組織當中。本研究中，補體C3和補體C4含量的增加是對惡劣環境的一種適應性策略，表明了大鱗副泥鰍補體系統的激活。

熱休克蛋白(HSPs)又稱應激蛋白，在高溫、缺氧、病原體感染、有機污染物和氧化等應激條件下，HSPs的合成速度會迅速增加[29]。其中，HSP70和HSP90在魚類先天性免疫和適應性免疫中起關鍵作用，包括激活先天免疫系統細胞[30]、介導體液和細胞免疫反應[31]以及作為膜結合配體來激活免疫系統[32]等。干旱條件下擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[33]和黃金鱸(Percaflavescens)[12]體內HSP70和HSP90的含量有所增加。海參(Apostichopusjaponicus)[13]與大鱗副泥鰍中HSP90和HSP70在干旱脅迫過程中都呈現先升高后降低的變化趨勢。其中大鱗副泥鰍血清中HSP70相較于HSP90具備增殖速度快，作用時間長的免疫應答特點；說明了HSP70在提高大鱗副泥鰍的抗應激能力和增強機體免疫中發揮著更大的作用。然而，由于HSPs誘導的樹突細胞和巨噬細胞活化會促進組織相容性復合體(MHC)的成熟，所以HSPs的過度增值會對魚類機體產生損害作用[34]。另外，羅東林等[35]指出，動物應激后高表達的HSP70可能會影響糖皮質激素發揮抗炎功能，從而導致創傷后繼發性肝損傷。也就是說氣呼吸型魚類可能會以免疫抑制來保護自身免于干旱脅迫的應激作用。本研究中，空氣暴露48 h后，機體HSP70和HSP90含量的下降也進一步支持了這一觀點。

作為魚類免疫系統的關鍵調節因子，炎癥或環境污染物均可引起炎癥細胞因子的變化[36]。在本研究中，不同時間的空氣暴露后，大鱗副泥鰍血清和肝臟中炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12)水平均呈現顯著升高的趨勢。大西洋鯛和斑馬魚空氣暴露后，肝臟當中TNF-α、IL-1β和IL-10等炎癥因子也呈現上調趨勢[37]。在氨脅迫下，暗紋東方鲀[38]和黃顙魚[4]中也發現了TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12轉錄水平的顯著增加，這與本實驗結果一致。此外，前期研究還發現HSPs的合成會導致TNF-α、IL-1β和IL-12轉錄水平的明顯上調[28,39]。干旱脅迫后，肝臟中各炎癥細胞因子指標的上升和回歸速度都十分迅速。這與肝臟炎癥細胞因子的雙重效應關系密切，一方面，TNF和IL作為肝細胞刺激因子，在發生應激反應以及其它情況的急性炎癥反應過程中可快速生成，并可誘導急性期反應蛋白的合成以維持內環境穩定、提高機體抗病力。另一方面，炎癥細胞因子也是肝臟壞死的重要因素，多項研究表明TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12等可誘導肝臟細胞的凋亡[40-42]。因此，肝臟中炎癥細胞因子的快速清除可能是大鱗副泥鰍為了保護肝臟免受損傷做出的負反饋調節，是機體為維持內環境穩定做出的免疫調節機制。

4 結論

綜上所述，空氣暴露顯著誘導了大鱗副泥鰍血清和肝臟總蛋白、白蛋白、球蛋白、IgM、補體成分、熱休克蛋白和炎癥細胞因子等免疫因子的增殖。肝臟作為魚類蛋白代謝和合成場所，其免疫因子通常在實驗早期就出現大量累積，反應速度較血清快。本實驗早期(0～48 h)大鱗副泥鰍的各項免疫指標均呈上升趨勢，說明短時間的空氣暴露刺激了魚體的免疫應答。實驗后期(48～96 h)多數上升的免疫指標逐漸下降，表明干旱和缺氧誘導的免疫刺激已開始轉變為免疫抑制作用。