金卷升板膠囊對模型大鼠血小板減少的改善作用*

韓艷叢，楊 琳，鄭玉玲，于 靜，周春華，劉清池，王玲嬌

（河北醫科大學第一醫院，河北 石家莊 050031）

特發性血小板減少性紫癜（ITP）是以人體血小板計數（PLT）降低（低于100×109/L）為主要特征的血液疾病。ITP癥狀多為瘀點、紫癜、黏膜出血（如鼻衄）等，甚至涉及顱內出血［1］。ITP死亡率超90%（有效治療前），治療后仍達10%，至少30%的患者在首次發作后復發。目前臨床共識推薦的常見治療方案為輸注血小板及促血小板生長因子［2］，但效果欠佳，費用昂貴，且藥品不良反應明顯［3-4］。金卷升板膠囊由金銀花、黃芩、茜草等10味藥材組方，具有清熱涼血、止血通絡功效，主治各種血小板減少癥［5-7］，且價格便宜、原料易得，近年來在我院臨床使用療效確切，但作用機制尚不明晰。本研究中探討了該藥對血小板減少模型大鼠凝血能力及脾臟系數的影響，以及對血小板減少的改善作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：MEX-7222 K 型全自動血細胞分析儀（日本Nihon Kohden公司）；CX23型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：注射用環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號為18100825）；金卷升板膠囊生粉（河北醫科大學第一醫院，批號分別為170813，170826，170901，170914）；咖啡酸片（德州德藥制藥有限公司，批號為181606013）；大鼠白細胞介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）測定試劑盒（美國ABclonal 公司，批號分別為9680002050519，9680002040119）；蘇木素（H）、伊紅（E）染液（珠海貝索生物技術有限公司，批號分別為719032，719012）。

動物：清潔級SD 大鼠36 只，雄性，10 周齡，體質量350 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（冀）2018 - 004，實驗動物使用許可證號SYXK（冀）2020- 002。飼養于河北醫科大學實驗動物房，通風，自由進食、飲水。本動物實驗經河北醫科大學第一醫院實驗動物倫理委員會批準（批件號20220712）。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組及給藥

將36 只大鼠隨機分為空白對照組（A 組，等體積生理鹽水），模型組（B 組，等體積生理鹽水），咖啡酸組（C 組，9 mg/ kg），以及金卷升板膠囊高、中、低劑量組（D1組、D2組、D3組，1.00，0.50，0.25 g/kg），各6 只。腹腔注射環磷酰胺溶液（100 mg/kg），每日1次，連續3 d，以復制血小板減少大鼠模型，同時A組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。以PLT減至建模前的20%～30%為建模成功［8］。建模開始后第5 天，各組大鼠予相應藥物或生理鹽水灌胃，每日1次，連續14 d［9］。

1.2.2 觀察指標

PLT：分別于建模前和給藥14 d 后取大鼠尾靜脈血檢測［9］，＜1 100×109/L為PLT減少。

凝血四項：末次給藥后，稱定大鼠體質量，腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈取血適量，分別置惰性分離膠促凝管和枸櫞酸鈉凝血實驗管中，取后者檢測凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）及纖維蛋白原（Fib）水平。

IL-10 及TNF-α：取前述惰性分離膠促凝管中的血液樣本，采用ELISA法檢測。

脾臟組織病理形態：處死大鼠，取出脾臟，稱定質量并計算脾臟系數（脾臟系數=脾臟質量/體質量）。將脾臟組織浸泡于福爾馬林溶液中固定，石蠟切片，HE染色，置顯微鏡下觀察［9-11］。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 PLT

與A 組比較，B 組大鼠給藥14 d 后PLT 顯著減少（P＜0.01）；與B 組比較，C組、D1組、D2組大鼠給藥14 d后PLT均顯著增加（P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠PLT比較（±s，×109/L，n=6）Tab.1 Comparison of PLT of rats in each group（±s，×109/L，n=6）

表1 各組大鼠PLT比較（±s，×109/L，n=6）Tab.1 Comparison of PLT of rats in each group（±s，×109/L，n=6）

注：與A 組比較，**P ＜0.01；與B 組比較，##P ＜0.01。表2、表3同。Note：Compared with those in group A，**P ＜0.01；Compared with those in group B，##P ＜0.01（for Tab.1-3）.

給藥14 d后1 112.50±188.28 311.33±32.10**688.00±75.23##888.83±83.16##614.50±66.10##344.17±17.87組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.009 1.00 0.50 0.25建模前1 015.83±108.77 1 143.83±110.24 1 125.67±95.52 1 086.17±102.12 1 169.50±75.39 1 131.00±107.03

2.2 凝血四項

與A 組比較，B 組大鼠的PT，APTT，TT 均顯著延長，Fib 水平顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組大鼠的PT，APTT，TT均顯著縮短，Fib水平顯著降低（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠凝血四項指標比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of four blood coagulation indexes of rats in each group （±s，n=6）

表2 各組大鼠凝血四項指標比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of four blood coagulation indexes of rats in each group （±s，n=6）

組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.009 1.00 0.50 0.25 PT（s）56.52±0.56 96.74±1.05**61.95±1.47##59.19±2.43##59.99±1.51##94.01±1.51 APTT（s）65.57±1.14 75.64±1.06**66.12±1.74##66.63±2.06##64.71±2.34##72.42±1.60 TT（s）61.01±1.59 92.48±1.14**62.03±2.93##62.07±1.97##61.10±1.74##90.43±0.91 Fib（g/L）22.49±1.91 30.32±0.89**24.16±1.50##23.28±1.39##23.72±0.87##28.65±0.86

2.3 IL-10 及TNF-α

與A組比較，B 組大鼠TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；與B 組比較，C組、D1組、D2組大鼠TNF - α 水平均顯著降低，C 組、D1組、D2組、D3組大鼠IL-10水平均顯著升高（P＜0.01）。詳見表3。

2.4 脾臟系數

與A 組比較，B 組大鼠脾臟系數顯著降低（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組大鼠脾臟系數均顯著升高（P＜0.01）。詳見表3。

表3 各組大鼠IL-10，TNF-α水平及脾臟系數比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of IL-10，TNF-α levels and spleen coefficient of rats in each group（±s，n=6）

表3 各組大鼠IL-10，TNF-α水平及脾臟系數比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of IL-10，TNF-α levels and spleen coefficient of rats in each group（±s，n=6）

組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.009 1.00 0.50 0.25 TNF-α（pg/mL）737.83±45.73 894.50±22.77**823.33±15.89##761.83±23.67##842.83±20.81##882.67±25.75 IL-10（pg/mL）425.50±17.26 255.50±22.47**359.67±17.68##392.83±15.85##341.33±19.92##326.17±28.10##脾臟系數（%）0.44±0.08 0.29±0.06**0.43±0.07##0.41±0.09##0.38±0.07##0.35±0.06##

2.5 脾臟組織病理形態

A 組大鼠脾臟組織的被膜、紅髓、白髓清晰；B 淋巴細胞較大，細胞膜完整，邊緣清晰，細胞核著色深且清晰不黏連。B 組大鼠脾臟組織的紅髓可見縮小，白髓有增大跡象，T 淋巴細胞顯著增多，紅髓的髓索、髓竇中出現大量的巨核細胞；T 淋巴細胞數量減少，呈膨大破裂，著色變淺，細胞內嗜酸性物質減少。與B 組比較，C 組大鼠脾臟組織的被膜、紅髓、白髓較清晰，B 淋巴細胞增多，細胞結構較完整；D1組、D2組、D3組大鼠脾臟組織的B淋巴細胞數量均有所增加，細胞核內的嗜堿性物質著色明顯，細胞核完整度較好。詳見圖1。

圖1 大鼠脾臟組織病理形態（HE，×200）Fig.1 Histopathological morphology of rat spleen（HE，×200）

3 討論

ITP 的血小板缺乏可能是由血小板產生減少，免疫介導破壞或脾液封存增加等原因引起［1］。80%的ITP 病例屬原發性，常被視為自身免疫性疾病；20%的ITP 病例為繼發性［12］。ITP 的主要癥狀為出血，程度可從無癥狀到頑固性出血，發病可為急性（持續時間少于3 個月或持續3～12個月），也可為慢性（持續12個月以上）。

常見血小板減少癥模型為免疫性血小板減少和藥物所致血小板減少［10］。前者建模時間長、費用高、操作復雜，且成功率低。而環磷酰胺的臨床常見不良反應是PLT 明顯減少，即中醫的血虛證［13-14］。研究表明，以環磷酰胺建模，可發生血小板減少，出血時間延長、凝血困難等，其模型比免疫性血小板減少造模法更經濟，易操作，效果確切［14-15］。

PLT 是評價血小板減少癥最直觀的指標［13-14］。研究認為血小板減少模型大鼠可出現凝血時間延長的現象，故凝血四項變化可作為衡量血小板減少程度的評判標準之一［15］。IL - 10 可抑制B 淋巴細胞生成血小板抗體，還可促進T 淋巴細胞的增殖、分化，從而緩解血小板的免疫性破壞［16］。ITP 患者PLT 減少可能受到TNF-α表達水平的影響［17］。脾臟系數是評價大鼠血小板減少模型的經典指標［16］。本研究中，與A組比較，B組大鼠PLT 顯著減少，IL - 10 水平、脾臟系數均顯著降低，TNF - α 水平顯著升高，PT，APTT，TT 均顯著延長，Fib 水平顯著升高，表明環磷酰胺致血小板減少大鼠模型復制成功。與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組的指標均有改善，表明金卷升板膠囊均可減輕模型大鼠血小板減少程度。

綜上所述，金卷升板膠囊可改善模型大鼠的血小板減少，其機制可能與升高IL-10及降低TNF-α水平，改善大鼠免疫指標有關。該研究為進一步探討該制劑具體活性成分和基于信號通路的作用機制提供了參考。