紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒高效液相色譜特征圖譜研究*

楊海燕，郭書臺，張志鵬，戴 涌，李 霞

（1.陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065；2.西安綠葉藥物研究有限公司，陜西 西安 710054）

紅景天為景天科植物大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba的干燥根和根莖，有益氣活血、通脈平喘功效，可用于治療氣虛血瘀、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘［1］。其含有豐富的黃酮類、有機酸類、多糖類、揮發(fā)油、蒽醌類、蛋白質(zhì)及無機元素［2-4］，化學(xué)成分較復(fù)雜。為全面控制其質(zhì)量，本研究中收集了15批紅景天藥材制成飲片，建立紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑［5］的高效液相色譜（HPLC）特征圖譜［6］，并將其引入對紅景天配方顆粒生產(chǎn)工藝的評價及成品質(zhì)量控制。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AU250D 型分析天平、10AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；BS110S 型分析天平（德國Sartorius公司）；KQ250型超聲波清洗機（上海科島自動化系統(tǒng)有限公司）；DY-2型恒溫水浴鍋（上海勝啟儀器儀表有限公司）；LABORTA4001 型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）；DZ-1BC 型真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；TQ-Z 型多功能提取罐、NH-1000 型蒸發(fā)濃縮器、RCYP- 150 型噴霧干燥塔、FZG-1400型真空干燥箱（陜西昌泰實業(yè)有限公司）；60B 型粉碎機（南京聯(lián)棚制藥設(shè)備有限公司）；HC200A 型混合機（寶雞中藥機械廠）；YK - 160 型搖擺式顆粒機（常州市迅馳干燥設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

紅景天苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110818-201708，含量＞98%）；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。紅景天藥材（15 批，采自西藏、青海、新疆、云南等地，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院王偉峰教授鑒定為正品）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.04 %磷酸水溶液，梯度洗脫（0～5 min 時5%A，5～35 min 時5%A→30%A，35～50 min 時30%A→40%A，50～60 min 時40%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：278 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 特征圖譜建立

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

取藥材樣品，經(jīng)凈制、浸潤，切成2～4 mm 厚片，自然陰干，制得飲片，取藥材飲片樣品100 g，加7 倍量水（浸過藥面4.5 cm），浸潤30 min，煮沸60 min，趁熱過濾（300目篩網(wǎng)，下同），藥渣再加6倍量水，加熱煮沸60 min，趁熱濾過，合并2 次濾液，減壓濃縮至500 mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2.2 溶液制備

取紅景天苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL 的對照品溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)湯劑5 mL，置25 mL 容量瓶中，加50%甲醇定容，超聲（功率150 W，頻率40 kHz）處理10 min，放冷至室溫，再加50%甲醇定容，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗：取2.2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，以紅景天苷峰為參照峰，計算各特征峰的保留時間和相對峰面積。結(jié)果的RSD均小于1.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別在室溫下放置0，5，10，15，20，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以紅景天苷峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD均小于2.0%；相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.4 參照峰和共有峰的選擇

以紅景天苷為對照［5-6］，取15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按2.1項下色譜條件進樣分析。結(jié)果15批紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 疊加特征圖譜（圖1）共分離出8 個共有峰，選取其中峰面積大于總峰面積5%的5個共有峰為標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜（圖2）。其中峰2（s）為紅景天苷峰。

圖1 15批紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑高效液相色譜疊加特征圖譜Fig.1 HPLC superimposed characteristic chromatograms of 15 batches of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma standard decoction

圖2 紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑高效液相色譜對照特征圖譜Fig.2 HPLC reference characteristic chromatograms of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma standard decoction

2.3 配方顆粒特征圖譜建立

2.3.1 配方顆粒制備

小試工藝：取藥材飲片樣品4 000 g（厚度0.2～0.5 cm，下同），加7 倍量水，浸泡30 min，加熱煮沸，微沸回流60 min，趁熱濾過，藥渣再加6 倍量水，加熱煮沸后微沸回流60 min，趁熱過濾，合并2 次濾液，55～60 ℃減壓（-0.08～-0.05 MPa）濃縮至相對密度為1.04～1.06（50 ℃測，下同，約相當(dāng)于飲片1 倍量，作為中間體），靜置，濾過，濃縮至相對密度為1.20～1.25，干燥，加入相當(dāng)于飲片量4%的麥芽糊精、95%乙醇適量制粒，20 目篩整粒，制成1 000 g。出膏率為14%～17%。每1 g 顆粒相當(dāng)于飲片約4 g。

中試工藝：取藥材飲片樣品50 kg，置多功能提取罐中，加7 倍量水，浸泡30 min，提取60 min，趁熱濾過（160目濾布，下同），藥渣再加6倍量水，提取60 min，趁熱濾過，合并2 次濾液，置蒸發(fā)濃縮器（溫度45～55 ℃，真空度- 0.09～- 0.06 MPa）濃縮得相對密度1.10～1.15 的清膏。噴霧干燥（進風(fēng)溫度100～120 ℃，塔內(nèi)溫度70～90 ℃，排風(fēng)溫度70～90 ℃）至水分小于4.0%，干浸膏粉碎過80目篩。取浸膏粉和麥芽糊精（1∶0.4，m/m）置混合機中混勻，在搖擺式顆粒機中用80%～90%乙醇制軟材，12目篩制粒，置真空干燥箱（45～55 ℃）中干燥至水分小于3.0%，10 目篩整粒，得紅景天中試配方顆粒。每1 g顆粒相當(dāng)于飲片3.33 g。

2.3.2 溶液制備

取紅景天苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.05 mg/ mL 的對照品溶液。分別取上述小試、中試配方顆粒樣品細(xì)粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取輔料麥芽糊精0.07 g，精密稱定，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：精密吸取2.2.2項下對照品溶液和陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖3。

圖3 紅景天配方顆粒高效液相色譜圖1.Salidroside A.Reference solution B.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma formula granules

精密度、穩(wěn)定性試驗：按2種試驗相關(guān)要求操作，以紅景天苷峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和峰面積。結(jié)果各特征峰上述2 個指標(biāo)的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好，供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

耐用性考察：采用3個不同廠家不同品牌的色譜柱［InertSustain C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），漢邦ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），月旭Ultimate@XB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）］，按選定色譜條件進樣測定，結(jié)果5 個共有峰均可得到良好分離，相對保留時間基本穩(wěn)定，表明色譜柱發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.3.4 共有峰確定

6批紅景天小試、中試配方顆粒樣品共檢出10個共有峰，其中與紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照圖譜相對保留時間一致的5個共有峰均檢出；其余5個峰中的4個峰，在部分標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中也出現(xiàn)過，但因面積較小未計入共有峰，另一峰可能為生產(chǎn)過程中引入，故配方顆粒HPLC 對照特征圖譜仍保留5 個共有峰，與標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 對照特征圖譜基本一致，5 個共有峰的相對保留時間均在規(guī)定值的± 5%以內(nèi)，說明小試、中試工藝基本可行，制成的配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑的主要化學(xué)成分基本一致。詳見圖4、圖5及表1。

表1 6批配方顆粒樣品高效液相色譜共有峰的相對保留時間Tab.1 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of six batches of formula granule samples

圖4 紅景天配方顆粒高效液相色譜疊加特征圖譜Fig.4 HPLC superimposed characteristic chromatograms of 15 batches of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma formula granules

圖5 紅景天配方顆粒高效液相色譜對照特征圖譜Fig.5 HPLC reference characteristic chromatograms of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma formula granules

3 討論

紅景天為藏醫(yī)臨床常用藥材，主產(chǎn)于西藏、四川、云南、青海等地的高寒地區(qū)［7］，最早收載于藏醫(yī)藥著作《四部醫(yī)典》。1977 年版《中國藥典（一部）》開始收錄紅景天，其后4 版中均僅收載在一部附錄，從2005 年版起明確基源為大花紅景天，收入一部正文［8］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅景天具有抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗缺氧、抑癌作用［9］，為防治高原缺氧的良藥，近年來，有研究報道其還能較好地干預(yù)治療阿爾茨海默病［10-11］。

15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜可反映出不同飲片之間的差異，最終選定的5 個特征峰均為共有峰，且峰面積均大于總峰面積的5%，共有峰總面積超過90%，一定程度上保證了共有峰的穩(wěn)定性。由于特征圖譜主要用于定性，受原藥材批次和生產(chǎn)工藝的影響，不同批次的配方顆粒5個共有峰峰面積有一定偏差，故暫未將相對峰面積納入評價體系。另外考察了紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的專屬性，以輔料麥芽糊精為陰性樣品，無明顯色譜峰，表明陰性對照無干擾。

綜上所述，本研究規(guī)范了紅景天標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝，并建立了其HPLC 特征圖譜，該方法可更有效控制紅景天藥材、飲片以及配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，也可通過對比標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒特征圖譜的一致性來評價、控制紅景天配方顆粒的生產(chǎn)工藝，以保障與臨床傳統(tǒng)湯劑藥效的一致性。