高效液相色譜法同時測定復方赤紅顆粒中沒食子酸和原兒茶酸含量*

鄭小麗，胡曉波，鄭志昌，李 明，楊繼紅，廖尚高

（1.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550001；2.貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550001）

復方赤紅顆粒為貴州醫科大學附屬醫院名中醫王光義教授的經驗方，該方由赤芍、川續斷、伸筋草、雞血藤、紅花、路路通、牛膝、獨活、杜仲、防風、川芎、秦艽、細辛和沒藥經現代工藝制備而成，有活血化瘀、舒筋活絡、抗炎止痛等功效［1-3］，臨床多用于治療風濕痹癥、關節疼痛、手腳冰冷等癥，療效較好。為進一步保證制劑質量穩定、使用安全性及臨床療效，本研究中參考文獻［4 - 5］，選擇制劑中沒食子酸和原兒茶酸為定量指標成分，并采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定兩者含量，旨在為該制劑的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；SPD-10A型紫外檢測器、WML-2006C-4型威瑪龍色譜數據工作站、TG332A 型分析天平（精度為0.01 mg），均購于島津儀器（蘇州）有限公司；LIBROR AEL - 160 型電子分析天平（常熟市雙杰測試儀器廠，精度為0.1 mg）；HS10260D 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

復方赤紅顆粒（貴州醫科大學附屬醫院，批號分別為20210301，20210302，20210303，規格為每袋10 g）；沒食子酸對照品（批號為110831 - 201906，含量91.5%），原兒茶酸對照品（批號為110809-201906，含量97.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Elite Supersil ODS - B C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-1%醋酸溶液（8∶92，V/V）；流速：0.9 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取干燥至恒重的原兒茶酸對照品10 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10 mL，取1 mL，用甲醇定容至100 mL，得溶液Ⅰ。取干燥至恒重的沒食子酸對照品10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加溶液Ⅰ溶解并定容，即得。

供試品溶液：取樣品細粉0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶內，精密加入2%醋酸溶液0.5 mL，再加入乙酸乙酯20 mL，超聲（功率260 W，頻率40 kHz）20 min，濾過，揮干乙酸乙酯，殘渣加2 mL甲醇溶解，濾過，取續濾液，即得。

空白對照溶液：按供試品溶液制備方法制備不加樣品的空白對照溶液［6-12］。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定。空白對照溶液色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜相應保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Gallic acid 2.Protocatechuic acid A.Mixed reference solution B.Test solution C.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取沒食子酸對照品溶液適量，加甲醇稀釋成質量濃度分別為50，100，200，400，800，1 600μg/mL 的沒食子酸系列對照品溶液；精密量取原兒茶酸對照品溶液，加甲醇稀釋成質量濃度分別為2.625，5.250，10.500，21.000，42.000，84.000 μg/ mL的原兒茶酸系列對照品溶液；均按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y沒=24 154X沒- 453 988（R2= 0.999 8，n= 6）和Y原=38 964X原-12 458（R2=0.999 9，n=6）。結果表明，沒食子酸和原兒茶酸質量濃度分別在50～1 600μg/mL 和2.625～84.000μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果沒食子酸和原兒茶酸峰面積的RSD分別為1.79%和1.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品（批號為20210301）溶液適量，分別于0，1，2，3，4，5 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果沒食子酸和原兒茶酸峰面積的RSD分別為1.35%和1.42%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置5 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為20210301）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果沒食子酸和原兒茶酸平均含量分別為0.936 8 mg/g和0.043 3 mg/g，RSD分別為0.95%和1.52%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為20210301）適量，共9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置100 mL容量瓶內，分別精密加入混合對照品溶液（含沒食子酸234.2μg/mL、原兒茶酸10.82 μg/ mL）0.8，1.0，1.2 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件分別進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，平行2份，每份約0.5 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中沒食子酸和原兒茶酸的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of the content determination of gallic acid and protocatechuic acid in samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 指標性成分選擇

復方赤紅顆粒由多味中藥材組方，成分復雜，目前尚無統一質量標準。沒食子酸和原兒茶酸具有抗炎鎮痛作用，是治療風濕痹癥的有效成分［13-14］，其含量直接影響該制劑的療效，故本研究中確定沒食子酸和原兒茶酸為該制劑的含量測定指標成分。

3.2 提取溶劑選擇

使用不同體積分數的甲醇、乙醇及乙酸乙酯等為提取溶劑，進行篩選和優化。結果顯示，以2%醋酸溶液+乙酸乙酯為提取溶劑時，沒食子酸和原兒茶酸的提取率均較高，故選擇其為提取溶劑。

3.3 超聲時間選擇

保持提取溶劑不變，考察不同超聲時間（10，20，30，40，50，60 min）對結果的影響。結果顯示，超聲20 min和30 min 的提取率和提取效率基本一致，且均高于40，50，60 min時，從提高工作效率及節約能源方面考慮，確定超聲時間為20 min。

3.4 方法評價

本研究中建立的HPLC 法專屬性好，分離度高，重復性好，操作簡單，結果準確可靠，可用于同時測定復方赤紅顆粒中沒食子酸和原兒茶酸的含量，并為下一步更有效地控制該制劑的質量提供參考。