高效液相色譜法測定羥丙甲纖維素中亞硝酸鹽含量

蓋 成，郝麗娟，閆 凱，徐艷梅，張素平

（河北省藥品醫療器械檢驗研究院，河北 石家莊 050200）

羥丙甲纖維素為半合成纖維素類輔料，廣泛用于藥物制劑［1-2］。其性質穩定［3-4］，通常被認為無毒、無刺激性，但其所含活性雜質會危害人體健康，還會與配伍藥物產生相互作用。研究發現，羥丙甲纖維素中常含亞硝酸鹽，殘留量過高時會對人體產生毒副作用，而一些含胺基團的藥物在一定條件下還可與亞硝酸發生系列反應，生成亞硝胺類的基因毒性雜質［5-8］。因此，監控羥丙甲纖維素中亞硝酸鹽含量對于減少藥物的毒副作用具有重要意義。羥丙甲纖維素收載于2020年版《中國藥典（四部）》，但質量標準中未涉及亞硝酸鹽的檢測。目前，亞硝酸鹽的常用檢測方法有比色法、紫外-可見分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法、熒光法等［9-16］，其中，比色法無法準確定量，紫外- 可見分光光度法、液相色譜法和氣相色譜法前處理多采用衍生方式，方法操作煩瑣，干擾較多，加之羥丙甲纖維素在水溶液中會發生明顯溶脹，在多數有機溶劑中也不能有效溶解，從而導致提取困難。為此，本研究中采用水和乙腈交替遞加的方式提取亞硝酸鹽，經萃取濃縮后，以高效液相色譜（HPLC）法測定含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XS105 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；MS3 型旋渦混勻器（德國IKA公司）。

1.2 試藥

羥丙甲纖維素（廠家A，批號分別為F07 - 01 -190102，F07 - 01 - 190201，F07 - 01 - 191201，F07 -01-210201，F07-01-210202，F07-01-210203）；亞硝酸根標準溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心，批號為206011 - 1，質量濃度為1 000 μg/ mL）；不含亞硝酸鹽的羥丙甲纖維素（實驗室制備）；乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、甲苯為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agela Venusil HILIC 親水色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸0.3 mL，加水1 000 mL，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至3.8）-乙腈（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL / min；檢測波長：205 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液制備

取樣品0.1 g，置10 mL 離心管中，精密加入乙腈2 mL，搖勻，加水1 mL 與100 mmol/ L 碳酸氫鈉溶液20μL，渦旋混勻；加水1 mL，渦旋混勻；加乙腈1 mL，渦旋混勻；加乙腈5 mL，渦旋混勻，離心，量取上清液8 mL，置50 mL 離心管中，加甲苯8 mL，振搖，靜置，分層后（必要時離心）棄上層溶液，再加入甲苯8 mL，重復操作；取下層溶液，經0.22μm 濾膜濾過，取續濾液，作為供試品溶液。取亞硝酸根標準溶液及不含亞硝酸鹽的羥丙甲纖維素適量，同法分別制備對照品溶液及陰性對照品溶液（因萃取過程導致兩相體積發生變化，兩者應與供試品溶液平行操作）。

2.3 方法學考察

專屬性試驗及系統適用性試驗：精密吸取2.2項下3種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應吸收峰，陰性對照無干擾。亞硝酸鹽與硝酸鹽分離度為7.6，理論板數按亞硝酸鹽峰計為21 362，分離度均大于1.5，基線分離良好，表明硝酸根離子不干擾亞硝酸根離子的測定。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Nitrite ion 2.Nitrate ion A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

其他離子干擾試驗：配制亞硝酸根離子質量濃度為250 ng/mL 的溶液，添加100倍質量濃度的常見無機陰離子（Cl-，SO42-，SO32-，PO43-，CO32-），按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果上述無機陰離子不影響亞硝酸鹽的測定。

線性關系考察：取亞硝酸根標準溶液，用水逐級稀釋，制成質量濃度分別為25，100，200，400，800，1 000 ng/mL的系列標準溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標，亞硝酸根離子質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=103.42X-1 069.6（R2=0.999 9，n=6），結果表明亞硝酸根離子質量濃度在25～1 000 ng/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限考察：取上述1 000 ng/mL 的亞硝酸根離子溶液，用水逐級稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）約為3，10 時的質量濃度分別作為檢測限和定量限。結果檢測限為10 ng/mL，定量限為25 ng/mL。

精密度試驗：取對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄亞硝酸根離子峰面積。結果的RSD為0.30%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批樣品（批號F07 - 01 -190102）0.1 g，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄亞硝酸根離子峰面積。結果的RSD小于1.0%（n= 5），表明供試品溶液室溫下放置8 h 內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為F07 - 01 -190102）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，共6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄亞硝酸根離子峰面積，并計算平均含量。結果亞硝酸根離子平均含量為6.53 mg/kg，RSD為0.90%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號F07 - 01 - 210201）0.1 g，共9 份，分別加入上述1 000 ng/mL 的亞硝酸根標準溶液0.4，0.8，1.2 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取樣品適量，平行3 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄亞硝酸根離子峰面積，計算樣品含量，并與傳統方法（無水乙醇超聲提取，亞硝酸鹽經衍生后用紫外- 可見分光光度法測定）的檢測值進行比較。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/kg，n=3）Tab.2 Results of the content determination of nitrite in samples（mg/kg，n=3）

3 討論

3.1 提取方法

羥丙甲纖維素為高分子化合物，生產過程引入的亞硝酸鹽不僅附著于樣品表面，還存在于高分子內部。預試驗中發現，乙腈對亞硝酸鹽有一定的溶解能力且不會使羥丙甲纖維素溶脹，但單用乙腈難以擴散進入羥丙甲纖維素內部，因此很難將其包裹的亞硝酸鹽洗脫出來，選用無水甲醇、無水乙醇時情況類似。本研究中采用水與乙腈交替遞加的方式，溶劑能有效滲入樣品內部并將亞硝酸鹽溶解，最后加入過量的乙腈，使羥丙甲纖維素重新沉淀，可避免溶解的羥丙甲纖維素損害色譜柱。用不同的提取方式來處理0.1 g 的羥丙甲纖維素并測定亞硝酸鹽含量加以驗證，結果，本研究中所建立的提取方法測得的亞硝酸鹽含量（7.18 mg/kg）明顯高于用傳統方法（乙腈和無水甲醇直接溶解并超聲），對樣品的提取更完善。

3.2 萃取次數

取80%乙腈水溶液、甲苯各100 mL，置分液漏斗中，充分振搖，靜置分層后取下層水溶液，配制質量濃度為250 ng/mL 的亞硝酸鈉溶液（溶液a）；用分得的上層溶液10 mL 重新提取溶液a（此時下層水液已分配平衡，重新提取時兩相體積不會發生變化），離心分層后，取下層液進樣，測得的結果與溶液a 比較，回收率為102%，表明用甲苯提取乙腈水溶液中乙腈的過程幾乎不造成水溶液中亞硝酸鹽的損失，為濃縮樣品溶液并盡量減少甲苯使用量，確定萃取次數為2次。

3.3 樣品處理量范圍

本研究中采用的提取溶劑中含有水分，而羥丙甲纖維素極易吸水并發生溶脹，過高的樣品量會使樣品吸水不均勻，導致提取不充分（可表現為線性相關系數降低），因此有必要考察樣品處理量。預試驗中取樣品（批號F07 - 01 - 190102）按2.2 項下方法提取并進行測定，結果表明，樣品處理量在0～0.15 g 范圍內與亞硝酸根離子峰面積線性關系良好，采用2.2項下方法能有效提取0.1 g羥丙甲纖維素中的亞硝酸鹽。

綜上所述，本研究中利用溶脹和消溶脹的過程，開發了一種有效的提取方法，可避免因羥丙甲纖維素的締合、包埋等因素的影響而使提取不充分。并建立了無需衍生的HPLC 法，操作簡便、準確度高，能測定樣品中痕量的亞硝酸鹽。