葡萄田間愈傷組織誘導研究

姜英，姜福莉，趙紫蝶，王娜，秦子禹

（河北科技師范學院園藝科技學院，河北秦皇島 066004）

果樹多倍體通常表現出樹壯、抗病、豐產、果大、無籽或少籽等優異性狀，多倍體育種己成為果樹品種改良的重要途徑。相對于蘋果、梨、桃等二倍體較大果型水果，多倍體葡萄的大果粒、無籽或少籽的優點顯得更為突出，因此葡萄多倍體育種也成為其種質創新的重要途徑。多年來雜交育種是葡萄多倍體育種的常規方法[2]，目前育成的多倍體葡萄品種約有68%為雜交方法育成[3]。人工誘變創造多倍體相對于傳統雜交育種具有時期短的優點，但傳統的田間莖尖多倍體誘變，嵌合現象嚴重，純化過程費時費力，組培條件下的多倍體誘變則存在進入田間評價需時較長等問題。因此田間誘導愈傷組織獲得純合多倍體成為一項更為理想的技術方法，不僅可以快速誘導獲得純合多倍體，而且加倍的不定芽當年可發育形成木質化枝條，用于嫁接擴繁，可大大縮短多倍體育種周期，同時還可徹底解決嵌合體純化難題[4]。

目前，在棗樹、榆樹、海棠、五角楓、石榴等植物中已成功建立田間愈傷組織途徑免嵌合體純化多倍體誘導[5-7]。在葡萄上，誘導愈傷組織大多是在離體條件下進行，并未進行田間多倍體誘導[8-17]。吳紅等[18]用‘維多利亞’葡萄試管苗單芽莖段誘導得到四倍體；集賢等[19]利用‘優無核’葡萄組培苗的不同芽位獲得多倍體；王敏琴等[20]報道了離體條件下誘導葡萄花藥、花絲產生愈傷組織，并利用秋水仙素溶液處理胚狀體及幼苗，獲得葡萄多倍體試管苗；楊曉明[21]利用莖段和葉片為外植體產生愈傷組織，并用秋水仙素溶液處理腋芽獲得多倍體。但這些報道大都是嵌合體，需進一步純化才能獲得純合多倍體。

目前，葡萄田間愈傷組織誘導多倍體鮮有報道。因此，本文以葡萄嫩枝為試材，研究了田間條件下包裹方式、激素等因素對葡萄新梢愈傷組織誘導的影響，為下一步從愈傷組織誘導葡萄多倍體或進行遺傳轉化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗地點

本試驗在河北科技師范學院園藝園林實驗站葡萄育種基地和昌黎縣施各莊葡萄育種基地進行。

1.2 試驗材料

試驗共設置7種處理方式，其中包裹方法、噻苯隆（TDZ）、硝酸銀（AgNO3）、短截時期、新梢粗度、短截部位的研究均用‘巨峰’葡萄為材料，基因型處理用‘巨峰’‘赤霞珠’‘溫克’‘A-09’葡萄為材料。樹齡均為7年生，避雨棚籬架栽培，常規管理模式。

1.3 試驗設計

于2021年5—8月，將葡萄新梢短截后用脫脂棉覆蓋截面，用膠頭滴管滴加激素，以浸濕脫脂棉為宜，一般需要滴加2～3 mL，最后進行包裹。

1.3.1 包裹方式對新梢截面愈傷組織的影響

新梢短截后，在截面覆上脫脂棉滴加激素TDZ（8.0 mg·L-1）和硝酸銀（2.0 mg·L-1）。新梢截面采用3種方式進行包裹，方式1（黑袋）、方式2（黑袋+濕泥+黑袋）、方式3（濕泥+黑袋）。每個處理短截新梢10個，重復3次，30 d后調查愈傷組織誘導率與愈傷組織等級情況，找出截面最佳包裹方式。在以下處理中均采用最佳包裹方式。

1.3.2 TDZ對新梢截面愈傷組織的影響

在新梢截面形成層滴加不同濃度的TDZ（4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg·L-1）+AgNO32.0 mg·L-1。每個處理短截新梢10個，重復3次，30 d后調查愈傷組織誘導率與愈傷組織等級情況。

1.3.3 AgNO3對新梢截面愈傷組織的影響

新梢短截后在截面形成層滴加AgNO3（2.0、4.0、6.0 mg·L-1）+TDZ 10.0 mg·L-1。每個處理短截新梢10個，重復3次，30 d后調查愈傷組織誘導率與愈傷組織等級情況。

1.3.4 短截時期對新梢截面愈傷組織的影響

分別在5月底、6月底和7月底將新梢短截，截面滴加TDZ 10.0 mg·L-1+ AgNO32.0 mg·L-1后進行包裹。每個處理短截新梢10個，重復3次，30 d后調查愈傷組織誘導率與愈傷組織等級情況。

1.3.5 新梢粗度對截面愈傷組織的影響

分別將直徑為0.6、1.0、1.2 cm的新梢進行短截，截面滴加TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后進行包裹。每個處理短截新梢10個，重復3次，30 d后調查愈傷組織誘導率與愈傷組織等級情況。

1.3.6 短截部位對新梢截面愈傷組織的影響

新梢短截部位分別在節間與節部，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后進行包裹。每個處理短截新梢10個，重復3次，30 d后調查愈傷組織誘導率與愈傷組織等級情況。

1.3.7 基因型對新梢截面愈傷組織的影響

以‘巨峰’‘赤霞珠’‘溫克’‘A-09’為試材，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后進行包裹。每個處理短截新梢10個，重復3次，30 d后調查愈傷組織誘導率與愈傷組織等級情況。

1.4 數據處理

新梢截面愈傷組織誘導量的分級標準參照文獻[22]并稍做修改，如下：

0：無愈傷組織；+：木質部和韌皮部之間可見愈傷組織；++：愈傷組織超出形成層，愈傷組織環更加明顯；+++：愈傷組織環繼續加粗，寬度約占截面半徑的1/5～1/2；++++：愈傷組織環約達截面半徑的1/2；+++++：愈傷組織環超過截面半徑的1/2；++++++：愈傷組織呈蘑菇狀溢出。

新梢愈傷組織誘導率（%）=截面出愈傷新梢數/短截總新梢數×100

試驗數據采用DPS數據處理系統進行統計分析，用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析，用不同字母表示其差異顯著性，大寫字母為（P<0.01），小寫字母（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 包裹方式對新梢截面愈傷組織的影響

如表1所示，方式1和方式2覆蓋后新梢截面愈傷誘導率最高達67%和73%，方式3的愈傷誘導率最低為50%。其中方式1的田間操作不僅包裹省時，還省去了濕泥的繁瑣，但是方式2的愈傷在顏色和質地方面好于方式1，且誘導率和愈傷組織等級都高于方式1。

表1 包裹方式對新梢截面愈傷組織的影響Table 1 Effect of wrapping method on callus of new shoot section

2.2 TDZ和AgNO3對新梢截面愈傷組織的影響

由表2可以看出，愈傷組織誘導率隨著TDZ濃度的增加而增加，濃度在4.0 mg·L-1和6.0 mg·L-1時誘導率最低，僅為30%；在TDZ 10.0 mg·L-1和12.0 mg·L-1時誘導率最高，達80%。但TDZ 10.0 mg·L-1的愈傷組織等級大于12.0 mg·L-1。所以本研究以TDZ10.0 mg·L-1為最佳截面愈傷組織誘導濃度。

表2 不同濃度的TDZ和AgNO3對新梢截面愈傷組織的影響Table 2 Different concentration of TDZ and AgNO3 on the callus of new shoot section

葡萄新梢短截后，在TDZ 10.0 mg·L-1附加AgNO3各濃度對截面愈傷組織誘導率有顯著影響。由表2可以看出，愈傷組織誘導率隨著AgNO3濃度的增加而降低，AgNO3濃度為6.0 mg·L-1時愈傷誘導率最低，為47%；在AgNO32.0 mg·L-1時的愈傷誘導率最高，達到80%，且愈傷組織等級和誘導率都顯著高于其它兩個濃度。所以以TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1為最佳截面愈傷組織誘導濃度。

2.3 短截時期對新梢截面愈傷組織的影響

由表3可以看出，5月下旬的愈傷誘導率最低，達50%；7月下旬的愈傷誘導率最高，達90%。

表3 短截時期對新梢截面愈傷組織的影響Table 3 Effects of short cut period on the callus of new shoot section

2.4 新梢粗度對新梢截面愈傷組織的影響

由表4可知，在新梢粗度1.0～1.2 cm時，新梢截面的愈傷組織誘導率達87%；新梢粗度1.0 cm以上時，新梢截面愈傷組織誘導率效果好；新梢粗度0.6 cm以下時，新梢截面愈傷組織誘導率最低，僅為33%。這是由于新梢粗度不同，木質化程度不同，新梢越粗，形成層越寬，可形成的愈傷組織環就越寬，更利于愈傷組織的形成。

表4 新梢粗度對新梢截面愈傷組織的影響Table 4 Effect of shoot thickness on callus of shoot section

2.5 短截部位對新梢截面愈傷組織的影響

由表5可知，節間和節部愈傷組織誘導率接近，為90%左右。在新梢節部營養豐富，易于愈傷組織形成，但是節部芽點較多，誘導后易于形成嵌合體，所以節間為最佳部位。

表5 短截部位對新梢截面愈傷組織的影響Table 5 Effect of short section on callus of new shoot section

2.6 基因型對新梢截面愈傷組織的影響

利用前面篩選的最佳包裹方式、激素組合、新梢粗度等處理，對4個葡萄基因型新梢進行截面誘導，所有基因型均成功誘導出愈傷組織。如表6所示，‘巨峰’和‘赤霞珠’的愈傷組織誘導率和等級都顯著高于其它兩個基因型，愈傷組織等級達到6級，其它兩個基因型愈傷組織等級為4級。‘巨峰’和‘赤霞珠’誘導率最高，達87%。‘溫克’的誘導率最低，為60%。

表6 基因型對新梢截面愈傷組織的影響Table 6 Induction of callus from new shoot sections of different grape varieties

3 討論

以往研究中，棗樹、榆樹、海棠、五角楓、石榴等植物中已成功建立田間愈傷組織途徑，這些植物一般選擇在多年生枝干截枝誘導愈傷組織。本科研團隊多年來在葡萄多年生枝蔓進行了截枝預試驗，結果樹會發生嚴重的整株死亡現象，這些都使葡萄田間誘導愈傷組織的難度加大。因此選擇對葡萄新梢進行截枝，很大程度減少了對樹體的傷害，同時利用不同包裹方式和激素組合成功誘導出了愈傷組織。

從愈傷組織存在部位和形態來看，其主要源于木質部和韌皮部之間的形成層。新梢被短截后裸露的截面極易風干，愈傷組織難以形成。因此，為得到新梢截面愈傷組織，采取覆蓋措施保護截面并搭配適宜的激素組合就顯得非常重要。本試驗設計的3種覆蓋方式中，由于葡萄新梢田間條件下愈傷組織誘導時間較長，最短也要15 d以上，所以包裹材料選用黑塑料袋和濕泥，以遮陰保濕為主要目的。就目前田間試驗情況來看，濕泥直接覆蓋截面，可以降低溫度，減少酚類化合物的合成，減少褐化，但因濕泥中混有雜菌，形成層直接接觸后極易霉變。所以本試驗對新梢截面采用了（黑塑料袋+濕泥+黑塑料袋）的三重長效保濕方式，第一層的黑袋起到了隔離截面雜菌的作用，第二層濕泥和第三層黑袋起到長久保濕的作用，利用該方法在葡萄新梢獲得了最佳愈傷組織誘導率。

另外，愈傷組織的獲得一般是將成熟的體細胞“逆轉”到分化程度較低的狀態并恢復其增殖能力，其中正常細胞的多少直接影響其分化與再生能力，獲得的愈傷組織遺傳性狀比較穩定[23-25]。激素濃度、新梢粗度、短截部位等均對愈傷組織誘導有顯著影響，本試驗采用TDZ復合AgNO3處理誘導愈傷效果顯著，最適宜的TDZ濃度為10.0 mg·L-1。AgNO3濃度的升高反而對愈傷誘導存在抑制作用，適宜的AgNO3濃度為2.0 mg·L-1，這與前人棗樹研究結果一致[26]。6—7月愈傷組織誘導率顯著大于5月，可能與溫度有關，昌黎地區5月底平均氣溫為20 ℃，低于7月底均溫27 ℃。彭向永等[27]研究表明，適宜愈傷組織產生的溫度范圍為25～28 ℃，低于或高于此溫度范圍時愈傷組織發生率均降低，這與本研究的結果一致。葡萄新梢比較細嫩，新梢越粗，愈傷誘導效果越好，但是過粗的新梢意味著更大的髓部，不利于愈傷組織的誘導，因此適宜的新梢粗度為1.0～1.2 cm。節間和節部的愈傷誘導率差異不顯著，愈傷組織等級有明顯差異，但是葡萄節部營養豐富，在后期芽的再生中易出現嵌合體，不能達到理想效果，所以節間為最佳部位。

芽的再生體系可通過田間和離體的方式獲得。到目前為止，葡萄芽再生研究基本都是在離體條件下進行[28-29]。但離體培養需無菌條件、人為補充光照，并且操作繁瑣、技術要求高、成本高、耗時長，獲得的組培苗生長緩慢，進入開花結果耗時較長[30]。而田間條件下樹體再生系數高，生長較快，再生芽當年可發育為木質化枝條，并能開花結果，誘變后易獲得純合體[31]。本試驗探究出了適于葡萄田間條件下直接誘導愈傷組織的最佳包裹方式和激素組合，且誘導的愈傷組織等級達到六級，為下一步從愈傷組織誘導出芽進而誘導同源多倍體奠定基礎，對于多倍體葡萄育種具有重要意義。

4 結論

本研究對葡萄進行了田間條件下直接誘導愈傷組織，7月底對直徑1 cm以上的葡萄新梢在節間進行短截，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+ AgNO32.0 mg·L-1后，采用黑袋+濕泥+黑袋的三重長效保濕方式進行覆蓋包裹，葡萄新梢愈傷組織誘導率可達90%。4個基因型中以‘巨峰’‘赤霞珠’誘導率較高，達87%。