葡萄果實酒石酸研究進展

楊巧鋒，李長林，裴忺，龔林忠，金莉，王俊芳，方林川

（1. 武漢市農業科學院，湖北武漢 430065；2. 湖北省農業科學院果樹茶葉研究所，湖北武漢 430209；3. 山東省葡萄研究院/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創新中心，山東濟南 250100）

有機酸是果實代謝的重要產物之一，其構成組分及含量的差異與水果風味和品質有著密切關系[1]。果實中存在的有機酸多種多樣，包括蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、草酸等，但果實往往以1～2種有機酸為主要積累目標。在葡萄果實中，酒石酸（2,3-二羥基丁二酸，Tartaric acid，TA）占有機酸含量的54.87%～69.78%，蘋果酸、檸檬酸、草酸分別占有機酸含量的25%、10%、5%左右[2-3]。酒石酸作為葡萄果實中的主要有機酸，不僅影響漿果的風味，也對葡萄酒的顏色、口感、微生物穩定性和陳釀潛力起著重要作用[4-5]。

酒石酸不僅在葡萄屬植物和天竺葵屬植物中富集，也存在于其它水果如荔枝、藍莓和一些柑橘類果實中，但在模式植物擬南芥中未見積累[6-7]。L-酒石酸是植物中酒石酸的主要形式，它的對應異構體D-酒石酸僅能在一些微生物種類中形成。葡萄作為典型的酒石酸型水果，葡萄汁的pH值主要取決于漿果中的酒石酸含量。更為重要的是，酒石酸作為葡萄酒“活力”的主要來源，平衡了酒精對味蕾的影響，并且有助于降低葡萄酒的pH值，使葡萄酒能夠保存一定的時間，這是基于酒石酸特有的強酸性，在發酵過程中不易被代謝的特性[8-9]。然而，隨著全球氣溫的升高，葡萄酒的保存和貯藏出現困難，這在很大程度上是由于葡萄的酸度受氣候影響。對不同葡萄品種的眾多研究均表明，氣候變暖會導致葡萄酸度下降，尤其是酒石酸含量顯著降低[10-11]。此外，酒石酸作為酸味劑和抗氧化劑具有很高的經濟價值，廣泛用于食品和釀酒工業[12-13]。因此，關于葡萄酒石酸合成及調控的研究對葡萄產業的發展具有重要意義。

酒石酸是抗壞血酸（Vc）分解代謝的產物[14-16]，但它在植物界的分布有限。與其它果實有機酸研究相比，酒石酸在植物代謝途徑中的功能及其合成途徑還所知甚少。隨著基因共表達網絡和全基因組分析工具的發展，酒石酸代謝相關的研究將會取得突破。因此，本文旨在綜述目前有關葡萄酒石酸生物合成途徑的酶、中間產物及其調控過程的研究進展，以期為酒石酸代謝的深入研究提供參考。

1 酒石酸在葡萄中的含量特性

L-酒石酸是一種四碳有機酸，它在葡萄漿果發育的早期階段合成，在葡萄開花后4周之內迅速積累，且在之后的發育過程中保持代謝穩定，未成熟果實中酒石酸的含量高于成熟果實[7,17]。早期的研究表明，酒石酸在葉片中合成，再轉運至漿果中進行積累，然而Hale[18]證實漿果也是酒石酸合成的場所。酒石酸的含量與漿果的大小密切相關，且在不同品種之間差異很大。對葡萄漿果生長發育過程中酒石酸分布變化的研究表明，在果實發育早期靠近果皮的果肉外側酒石酸含量最高，而在轉色之后，果肉外側酒石酸濃度迅速下降，而在其它組織中基本保持不變[19]。

對302份成熟葡萄樣品有機酸組分特征及含量分布規律的研究發現，栽培品種葡萄的酒石酸含量高于蘋果酸，大多數野生種葡萄中蘋果酸含量高于酒石酸，中國野生種葡萄也屬于高蘋果酸類型[3,20]。對不同種群葡萄果實中有機酸含量的比較表明，東亞種群葡萄果實的有機酸含量均高于其他種群，尤其是酒石酸含量顯著高于其他種群[3]。

2 酒石酸生物合成途徑的中間產物及酶類

酒石酸的合成分為兩個階段：上游抗壞血酸合成階段，下游抗壞血酸分解即合成酒石酸階段。在高等植物中酒石酸的合成有三條途徑，分別稱為抗壞血酸C4/C5途徑、抗壞血酸C2/C3途徑和D-葡萄糖酸C4/C5途徑（圖1）。抗壞血酸C4/C5途徑是葡萄中酒石酸合成的主要途徑，在該代謝途徑中，抗壞血酸首先轉化為2-酮基-L-古洛糖酸，之后還原生成L-艾杜糖酸，再氧化生成六碳化合物5-酮基-D-葡萄糖酸。這個六碳中間體被未知的酶裂解生成一個四碳化合物，該中間產物即酒石酸半醛，并最終氧化生成酒石酸。在抗壞血酸C2/C3通路中，抗壞血酸在2位和3位碳之間裂解，形成二碳化合物草酸和四碳化合物L-蘇氨酸，四碳化合物最終氧化生成酒石酸。D-葡萄糖酸C4/C5途徑，只在豆科植物中被鑒定，D-葡萄糖酸直接轉化為5-酮基-D-葡萄糖酸，之后通過與抗壞血酸C4/C5相同的步驟生成酒石酸[15-16,21]。

2.1 酒石酸合成前體物質抗壞血酸的主要合成途徑

新鮮水果以富含Vc深受喜愛。然而，葡萄并不像其他水果那樣積累大量的Vc，因為其中的Vc作為草酸和酒石酸合成的前體物質被消耗。抗壞血酸是生長發育所必需的多功能代謝物，是一種重要的抗氧化劑，參與植物防御非生物脅迫。抗壞血酸合成的主要途徑是Smirnoff-Wheeler途徑，也稱為L-半乳糖途徑，該途徑也是葡萄中抗壞血酸合成的主要途徑（圖1），共有10種酶類參與。具體過程為D-葡萄糖依次在己糖激酶（HXK）、磷酸葡萄糖異構酶（PGI）、磷酸甘露糖異構酶（PMI）、磷酸甘露糖變位酶（PMM）及GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）作用下生成GDP-D-甘露糖。之后，該途徑的第六個酶類：GDP-D-甘露糖-3'5'-異構酶 （GME）催化GDP-D-甘露糖生成GDP-L-半乳糖。GME是新陳代謝中的一個“節點”，因為GME不僅是抗壞血酸生物合成途徑的關鍵酶，還是細胞壁生物合成途徑的關鍵酶，參與非纖維素多糖的合成，因此，它可以控制碳流向抗壞血酸合成通路。隨后，在GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP/VTC2）、L-半乳糖-1-磷酸酯酶（GPP/VTC4）和L-半乳糖脫氫酶（GLDH）催化下分別產生L-半乳糖-1-磷酸、L-半乳糖和L-半乳糖-1,4-內酯，而L-半乳糖是該合成途徑中的關鍵物質。最后，L-半乳糖-1,4-內酯脫氫酶（L-GalLDH）特異性催化L-半乳糖-1,4-內酯生成抗壞血酸，參與L-抗壞血酸生物合成最后一個階段[22-23]。

圖1 植物中抗壞血酸和酒石酸氧化還原合成途徑Figure1 Biosynthesis and redox pathways of ascorbic acid and tartaric acid in plant cell

2.2 L-艾杜糖酸脫氫酶

L-艾杜糖酸脫氫酶（L-IDH）是酒石酸合成途徑第一個被鑒定和分析的酶，催化L-艾杜糖酸到5-酮基-D-葡萄糖酸的限速步驟[14,24]。在葡萄中該基因家族有三個成員，都定位在16號染色體上，其中VvLIDH1和VvLIDH3在基因上相距10kb，基因方向相同，然而VvLIDH2與它們方向相反，表明VvLIDH家族的不同成員由不同的啟動子調控[25]。轉錄分析表明，VvLIDH1和VvLIDH3在幼果中的表達量高，這也與酒石酸開始積累的時間一致[26-28]。利用L-IDH抗體和漿果提取物的酶活分析發現，L-IDH蛋白豐度及其活性在果實發育早期達到高峰，與VvLIDH1和VvLIDH3的表達量一致[29-30]。

VvLIDH3（又稱為Q1PSI9）是目前葡萄中唯一被證實能夠氧化L-艾杜糖酸的家族成員[14]。表達譜分析表明，葡萄成熟漿果中VvLIDH3的表達量在夜晚升高[31]；運用CRISPR/Cas9突變技術敲除VvLIDH3，導致酒石酸含量下降[32]。VvLIDH3屬于“II類”植物山醇脫氫酶（SDH），它含有一系列關鍵氨基酸殘基（His42、Gly112和Ser113）負責L-艾杜糖酸的結合和氧化，這些重要的氨基酸殘基在葡萄VvLIDH1中同樣保守。VvLIDH1與VvLIDH3具有高度一致性，只在非關鍵位點的3個氨基酸殘基不一致[33-34]，然而VvLIDH1在酒石酸合成中的功能還不明確。此外，負責艾杜糖酸結合的關鍵位點在天竺葵植物中也非常保守。VvLIDH2屬于“I類”SDH，其參與山梨醇代謝，而不是酒石酸的合成。I類和II類SDH的表達模式不一樣，前者表達量在植物發育整個過程中不斷增加，后者與酒石酸合成的時間更加接近，在發育過程中表達量減少[19,34]。

在蘋果和甜橙中，存在L-IDH同源基因，而它們并不積累酒石酸。對蘋果基因組的進一步分析發現，12個L-IDH同源基因中，有11個與VvLIDH3的相似性低，并且缺少關鍵的氨基酸殘基，僅有1個拷貝的植物“II類”SDH[35-36]。此外，對中國野生葡萄烏頭葉蛇葡萄（Ampelopsis aconitifolia）的研究發現，其缺少L-IDH轉錄本并且沒有酒石酸積累，進一步表明L-IDH對于酒石酸積累是必須的，也是葡萄漿果中酒石酸合成途徑中最具特征的酶[14]。

2.3 2-酮-L-古洛糖酸還原酶

2-酮-L-古洛糖酸還原酶（2-KGR）催化2-酮-L-古洛糖酸生成L-艾杜糖酸。葡萄中存在與大腸桿菌2-KGR同源的基因，并且該基因與VvLIDH3表達模式相同。體外研究發現，該重組酶具有2-KGR酶的活性，底物親和動力學試驗發現，其主要活性為乙醛酸或羥基丙酮酸還原酶[12,37]。進一步研究發現，葡萄Vv2KGR與擬南芥羥基丙酮酸還原酶（AtHPR2）具有高度相似性，該酶參與羥基丙酮酸和乙醛酸還原代償旁路[38]。然而，重組表達的Vv2KGR對L-艾杜糖酸、抗壞血酸、甲酸、山梨醇糖、D-葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸鹽、5-酮-D-葡萄糖酸和D-葡萄糖酸都具有催化活性，但催化效率不高。利用X-射線晶體學和分子對接技術對Vv2KGR蛋白結構進行解析發現， 2-酮-L-古洛糖酸是最佳底物，并且GC-MS也證實該催化反應的產物是L-艾杜糖酸[12]。Vv2KGR與VvLIDH3在進化上類似，它們都保留了其原始酶活，即乙醛酸還原酶和山梨醇氧化酶活性，并且分別進化出新的功能參與酒石酸的合成。

2.4 轉酮醇酶和酒石酸半醛脫氫酶

除了Vv2KGR和VvLIDH3，目前還沒有對酒石酸生物合成途徑中其余步驟的候選基因進行鑒定，包括酒石酸合成的第一個步驟，即從抗壞血酸或脫氫抗壞血酸轉化為2-酮-L-古洛糖酸，以及最后兩步，即5-酮基-D-葡萄糖酸轉變成酒石酸半醛，然后變成酒石酸（圖1）。有學者提出轉酮酶（TK）可以將5-酮-D-葡萄糖酸裂解成4C和2C片段，最早發現轉酮酶的作用是在卡爾文循環或磷酸戊糖循環途徑中，但推測其可能在某些條件下以5-酮基-D-葡萄糖酸酯作為底物。酒石酸合成最后一步反應的催化酶類，推測是酒石酸半醛脫氫酶（TSDH），它可能是琥珀酸半醛脫氫酶或其異構體，進化過程中將酒石酸半醛作為新的首選底物[34]。

2.5 酒石酸合成其它相關候選基因研究

盡管酒石酸只在有限的植物種類中存在，但是存在多條生物合成途徑。在牻牛兒苗科植物中，抗壞血酸C2/C3途徑是合成酒石酸的主要途徑。然而，在葡萄果實中，抗壞血酸C2/C3途徑主要產生L-蘇氨酸和草酸，酒石酸來源于另外一個單獨的C4/C5途徑。目前還不清楚為什么在葡萄中已經存在抗壞血酸C2/C3裂解方式，還進化出一條新的酒石酸合成途徑。有一種推測可能是負責將L-蘇氨酸轉化為酒石酸的酶在葡萄中缺乏或者不活躍[35]。此外，除了葡萄屬和天竺葵屬植物，在馬鈴薯、柑橘類水果和梨中也檢測到少量的酒石酸。這3個物種已經被證明包含一個L-IDH異構體或“II類”SDH。牛油果和羅望子也被認為是酒石酸型水果，這些植物也可能成為研究不同有機酸分布、酒石酸遺傳和代謝的有用模型[19,34]。此外，利用廣泛靶向代謝組學檢測酒石酸合成的前體物質也有助于尋找酒石酸合成的其它步驟。

為了克服生化方法的局限性，利用QTL定位和全基因組關聯分析（GWAS）來尋找定位酒石酸合成的遺傳位點。過去十年，葡萄漿果酸度相關QTL的研究有一些突破，如與總酸度、可滴定酸、pH，以及蘋果酸和幼果中各種酸比例相關的研究。然而關于酒石酸的遺傳位點研究沒有重大突破[1,39]，這可能與酒石酸合成途徑眾多、調控位點復雜以及受多種因素影響等相關。盡管存在這些挑戰，研究者利用矮化與持續開花突變體Picovine與‘白玉霓’無果肉突變體Ugni Blancflb雜交構建的遺傳群體，在連鎖群LG7和LG4上發現了兩個酒石酸相關的重要并且穩定的QTL位點[40]。此外，全基因組關聯分析在葡萄復雜生物學性狀方面的應用越來越多。最近，研究者利用472份葡萄種質資源全基因組測序和GWAS分析了許多葡萄性狀，包括酒石酸積累，鑒定到氧化還原酶超家族的一個潛在的去乙酰氧基-4-羥化酶。該酶催化2-氧戊二酸鹽（五碳化合物）氧化為琥珀酸（四碳化合物），因此，推測該酶可能參與酒石酸合成的后兩步反應過程，比如轉化5-酮基葡萄酸生成酒石酸，不過仍然需要進一步試驗證明該基因在酒石酸合成中的作用[41]。此外，對279份葡萄品種的GWAS分析也鑒定到與酒石酸積累相關的基因座[42]。

3 酒石酸在細胞內的轉運

酒石酸一旦合成，就被轉移到液泡中儲存起來。鋁激活的蘋果酸轉運蛋白VvALMT9很有可能參與蘋果酸與酒石酸從胞質到液泡中的運輸過程[43]。轉錄組和qPCR結果顯示，VvALMT9在葡萄漿果發育的整個過程都有表達，在成熟果實中的表達量最高，說明該酶的活性在蘋果酸和酒石酸積累之后，會持續保持比較高的活性。目前在植物細胞其他膜結構中還沒有發現酒石酸運輸的候選蛋白，但是已發現有一些與酒石酸前體抗壞血酸運輸的候選蛋白。擬南芥中有12個抗壞血酸鹽轉蛋白（NAT）的候選基因，其中有3個（AtNat7、8、12）定位在細胞膜[22,43]。未來，在葡萄中分析與這些基因共表達、共定位的候選基因將有助于酒石酸轉運的研究。

4 酒石酸代謝

葡萄漿果中的酒石酸形成穩定的酒石酸鉀鹽，儲存在液泡中，遠離潛在的分解代謝酶類，因此在成熟過程中酒石酸基本不受影響[34]。大腸桿菌和假單胞菌可以將D-酒石酸鹽作為碳源，通過氧化作用轉化為草酰乙酸或甘油酸，最終轉化為丙酮酸。L-酒石酸能夠被農桿菌通過碳固定的方式利用，該菌體是葡萄的宿主菌，其含有酒石酸代謝相關基因[44]。葡萄中的L-酒石酸鹽能夠被灰霉菌代謝，產生不同的有機酸，包括蘋果酸、丙酮酸、醋酸鹽、草酸和草酰乙酸等[45]。因此，當葡萄漿果完好無損時，酒石酸不會被分解，然而一旦遇到機械損傷或者病原菌入侵，酒石酸可能會被這些微生物代謝利用[35]。

5 酒石酸合成的調控

溫度和光照會影響果實有機酸組分，這不僅關系到果實品質，而且關系到品種與其最適生長區在未來氣候變化中的兼容性。然而，環境因素對漿果有機酸含量的影響在很大程度上取決于遺傳背景，并且與漿果的發育階段和栽培措施也有關系，這使得有機酸合成調控的研究更加復雜。歐亞種葡萄中蘋果酸的含量隨著光照強度的增加而降低，并且隨著水分供應的減少而降低[46]。然而，目前關于環境條件對酒石酸生物合成調控的研究進展還較少。對比法國夏朗德地區不同氣候條件對栽培種葡萄酒石酸合成的影響發現，葡萄中抗壞血酸和酒石酸的總量及濃度受到氣候條件的影響。2011年（少雨、高溫）成熟葡萄中酒石酸的總量及濃度是2013年（濕潤、涼爽）的2～3倍。進一步的酶活分析發現，L-IDH酶活的第一個峰值出現在抗壞血酸水平最高的時候，并且隨之帶來酒石酸的大量積累。通過調查氣候對不同生長階段漿果酒石酸含量的影響，發現在幼果階段，強光和限制水分能夠促進抗壞血酸和酒石酸的合成[8]，但在成熟階段，光照對酒石酸含量的影響不明顯[19]，高溫可以改變漿果中氨基酸和有機酸的濃度，然而成熟漿果中酒石酸的含量不受溫度的影響[47]；此外，遮蔭處理導致漿果中L-酒石酸的濃度降低，同時漿果的粒質量減小，抗壞血酸總量減少，但草酸和蘋果酸的濃度不受遮蔭處理的影響[32]。為了進一步探索酒石酸合成途徑中的遺傳調控，開展啟動子結構遺傳分析、尋找合成途徑的新酶類如催化5-酮基-D-葡萄酸到酒石酸的酶類，可能有助于取得新的進展。

6 展望

葡萄果實糖酸含量及其構成比例直接決定了果實品質，不同品種果實的有機酸含量與組分差異較大，篩選或培育高糖高酸的釀酒品種或高糖低酸的鮮食品種，對葡萄產業發展具有重要意義。酒石酸作為葡萄中的主要酸類，盡管50多年前已經被發現，然而對葡萄中酒石酸生物合成途徑的生化和遺傳機理研究還不夠深入。繼續利用傳統的生化和分子方法可能會產生更多的候選基因，但也需要考慮其它可能性，也許酒石酸合成是非酶促反應，或一種酶負責多個步驟[19]。與此同時，可以分析常見代謝途徑中的酶類是否具有潛在的其它功能，例如尋找那些表達模式與Vv2KGR和VvLIDH3一致，并且與酒石酸合成時間和部位一致的基因[34]；再利用生物信息學和葡萄基因組數據庫，通過序列比對的方法在葡萄全基因組范圍內鑒定相關家族基因，并對其進化關系、基因定位、蛋白質結構和性質進行分析。

QTL定位在基因克隆及篩選鑒定方面起著重要作用，基于雙親本群體得到的圖譜，鑒定出非常多的與果實品質性狀相關的QTL和基因，可能會由于特定親本品種或種類之間有限的遺傳多樣性受到限制，因此，選擇適當的雜交親本是酒石酸QTL定位成功的關鍵。隨著高通量測序成本的降低，收集大量的種質資源進行GWAS分析有助于探明酒石酸在葡萄中的合成及遺傳調控規律。利用SNP標記進行全基因組關聯分析，找到與酒石酸含量性狀顯著相關的SNP位點，在此基礎上對候選基因進行挖掘分析，還可以定位酒石酸相關的標記位點，為葡萄的品質育種提供一種切實可行的基礎手段。