基于流感疫苗生產用MDCK細胞的安全性評價

康碧靜，馬芳芳，馬春英，王美皓，喬自林，王家敏*

（1.西北民族大學生物醫學研究中心甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州百靈生物技術有限公司，甘肅 蘭州 730010；4.蘭州民海生物工程有限公司甘肅省生物工程材料工程研究中心，甘肅 蘭州 730010；5.西北民族大學生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

MDCK細胞是Madin和Darby于1958年從一只雌性成年可卡犬腎臟組織中分離得到的一株細胞系[1]。體外培養過程中，MDCK細胞形成自發永生化，研究發現，其對A型和B型流感病毒，柯薩奇病毒B3、B4和B5，呼腸孤病毒，脊髓灰質炎病毒等都具有易感性[2]。因此，MDCK細胞是世界衛生組織推薦的最適宜生產流感疫苗的細胞系之一[3]。目前，生產MDCK細胞基質的流感疫苗主要有：2001年，Solvay公司生產的三價流感疫苗Influvac? TC在荷蘭獲得審批，但由于生產延誤而未上市；Novartis公司使用無血清懸浮培養的細胞系MDCK 33016-PF生產的三價亞單位疫苗Optaflu?在歐盟獲得審批[4]；Seqirus公司四價流感疫苗Flucelvax? Tetra于歐盟上市；在美國，Flucelvax Quadrivalent?獲得審批上市[5]。相比傳統雞胚基質流感疫苗，細胞基質疫苗具有以下優勢：一是生產過程都在生物反應器中進行，全程質量監控，保證了無菌性及產品質量[6]；二是如遇禽流感暴發，可有效避免雞胚供應受限的影響[7]；三是雞胚基質在病毒繁殖過程中會產生適應性變異，而細胞基質無此問題[8]；四是靈活性強、成本低，保障了對雞胚過敏人員的疫苗供應。但在生產過程中發現，MDCK細胞在裸鼠體內注射后會使裸鼠產生腫瘤。如李六金等[9]用包括MDCK細胞等5種傳代細胞系對裸鼠進行注射，發現在30代以后，MDCK細胞會使裸鼠形成腫瘤。因此，MDCK細胞在疫苗生產中的安全性存在爭議?；诖?，對MDCK細胞在流感疫苗生產安全性方面進行評價非常有必要，也是疫苗獲得審批的關鍵。

1 MDCK細胞成瘤性研究

細胞成瘤性是指細胞在接種動物后，接種細胞在動物體內形成（腫）瘤的過程，成瘤性檢查是確定細胞形成（腫）瘤的能力。通常對裸鼠或抗胸腺血清（ATS）處理過的新生小鼠進行皮下接種，每只接種107個活細胞，在觀察至少4個月后處死，取出腫瘤以及其他器官（心、肝、脾、肺、腎、腦、部分淋巴結）進行組織學檢測，判斷是否有成瘤性[10]。美國FDA和歐洲藥典的檢測方式基本相似。1976年，Stiles等[11]在BALB/c裸鼠的肩胛骨進行細胞注射來檢驗其細胞成瘤性，每周測量裸鼠肩胛骨結節尺寸，當長度超過5 mm時，細胞系歸為致瘤細胞系，接種細胞數量為106/只。結果在新生裸鼠上注射時，MDCK細胞使裸鼠生長出0.5～0.6 mm的結節，結節生長在30 d以內，當裸鼠體重到達成年體重時，結節不再生長。而在抑制其免疫能力的成年裸鼠中注射時，細胞數量不變，未能形成結節。從結節中提取出活的MDCK，通過組織學切片檢測發現結節不是連續的腫瘤塊，而是含有單層柱狀上皮細胞的空心球。李六金等[9]對5種動物傳代細胞系：MDCK、Vero、F81、BHK21、MA-104進行裸鼠注射來檢測其成瘤性。研究發現，F81、Vero和MA-104有腫塊形成，但經過組織學檢查發現腫塊并非腫瘤，因此不是成瘤性細胞系。MDCK細胞在30代以下不具有成瘤性，在30代以上形成的腫塊進行組織學切片發現大部分為皮膚組織和肉芽組織，且有壞死，而一部分結節為纖維性肉瘤細胞，異型性明顯，將MDCK細胞裂解后接種于裸鼠皮下，無腫塊形成，因此，MDCK細胞裂解物沒有致瘤性。MDCK細胞的成瘤性主要通過2個參數評估：腫瘤形成能力和腫瘤潛伏期。腫瘤形成能力可以用腫瘤形成劑量的log1050%來表示，簡稱TPD50；腫瘤潛伏期是指腫瘤出現的時間，可以用2種方法表示，一種是生存曲線，另一種是接種到出現腫瘤的時間。研究發現，MDCK細胞成瘤性有異質性，即不同MDCK細胞系成瘤率和腫瘤形成時間不同，從ATCC不同時間引進3株不同的MDCK細胞系，進行裸鼠注射，細胞株1的TPD50為4.4，細胞株2的TPD50為5.2，細胞株3的TPD50為5.8。腫瘤潛伏期也可反映其異質性，每只裸鼠106的注射條件下，3株細胞系的潛伏時間也不相同。關于這種異質性，有2種解釋，一種是在細胞傳代過程中，產生了成瘤表型突變；另一種是在不同的細胞批次中含有致瘤表型不同的細胞亞群，每個亞群在體內形成腫瘤的能力不同[12]。Ganguly等[13]使用無胸腺雌性小鼠進行成瘤性試驗，每10只為一組，每只107個細胞進行皮下注射，陽性對照為HT-29細胞；后又進行TPD50研究，使用雌性免疫缺陷小鼠進行皮下注射和鼻內注射，皮下注射MDCK細胞濃度分別為101、103、105、107個活細胞/只，陽性對照Hela為107個活細胞/只，而鼻內注射細胞濃度為106個/只，陽性對照Hela和陰性對照Mrc-5也是同樣濃度。后又用新生免疫缺陷小鼠、新生倉鼠、新生大鼠檢測MDCK細胞致瘤性。結果表明：皮下注射小鼠從第9～40 d腫瘤體積增長，陽性對照腫瘤體積比MDCK細胞組大，組織學觀察未見腫瘤轉移，TPD50為1.9×104個細胞。通過注射MDCK細胞裂解物及DNA發現除有1只大鼠出現腫瘤外，其余均無腫瘤產生，鼻內注射3株細胞皆無腫瘤產生，因此鼻內給藥的途徑不具有成瘤性。

2 MDCK細胞致瘤性研究

中國藥典中規定，致瘤性是指細胞成分接種動物后，誘導動物細胞本身產生腫瘤[10]，具有致癌風險。為了檢測細胞致瘤性，將待測細胞DNA注射進新生裸鼠、倉鼠、免疫缺陷小鼠，經過至少4個月觀察，處死后檢查是否有腫瘤產生、是否有病灶轉移。經研究發現，MDCK細胞不具有致瘤性，也就是說MDCK不會有致癌性。張德禮等[14]將4株MDCK細胞進行完整細胞注射和裂解物注射，4株MDCK細胞系注射完整細胞裸鼠有腫瘤生成，而裂解物均未產生腫瘤，此結果與Ganguly等[13]研究結果一致，其中一只成瘤的大鼠經過組織學檢查發現腫瘤為良性。因此，MDCK完整細胞雖然具有成瘤性，但其裂解物及DNA沒有致瘤性或致癌性。根據世界衛生組織對細胞基質的要求，每劑量疫苗DNA殘留量不得高于10 ng，另有研究證明如果在體內有1 ng細胞的DNA，而基因組中有100個激活的致癌基因拷貝，則發生轉化的概率為1/109[15]，哺乳平均基因為3 000～10 000個堿基對，假設該哺乳動物基因組中DNA殘留量為10 ng，則該動物基因組中致癌基因為0.000 01～0.000 1 ng，目前沒有證據表明致癌基因及其他DNA在此數量級水平有生物活性[16]。

3 應對策略

MDCK 33016-PF細胞可生產三價流感疫苗Optaflu?，但由于MDCK細胞的成瘤性，為了保證生物制品的安全性，必須要求疫苗中不含活細胞，保證細胞裂解物不致癌，保證細胞底物不含致癌病毒或致癌DNA。因此，有一系列后續純化工藝來確保其安全性。為了過濾細胞，首先進行一個初始的離心步驟可過濾99%的細胞，其次進行一次0.45 μm的過濾，再進行兩次0.2 μm的過濾，最后再經過0.2 μm的無菌過濾，MDCK細胞直徑約15 μm，而過濾孔徑很容易去除大量MDCK細胞，過濾的細胞依次大于9.2 log10、8.8 log10、8.8 log10、8.8 log10數量級；又經過化學過濾，β-丙內酯、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）以及聚山梨酯80（Tween 80）都可使MDCK細胞失活，通?？墒? log10數量級細胞失活。過濾純化后，每劑疫苗存在活細胞的概率為1/1034，而DNA的殘存量規定每劑量不超過10 ng。為了去除DNA，純化步驟包括硫酸纖維素離子交換層析和隨后的CTAB沉淀步驟，其中β-丙內酯可與DNA發生反應，使DNA斷裂，降低DNA聚合酶活性。這些生產步驟都能有效去除DNA殘留，使99.99%以上的殘余DNA長度低于200 bp，遠遠小于編碼致癌蛋白1 000 bp的長度，且凝膠電泳未檢驗出大于200 bp的DNA片段[17]。因此，通過對MDCK致瘤性的研究和生產工藝的質量控制，可保證疫苗生產的安全性。

理論上選用低成瘤甚至無成瘤的細胞系可大大降低疫苗成瘤性風險，Liu等[18]通過有限稀釋法克隆出MDCK 9B9-1E4，通過對其成瘤性、致瘤性進行研究發現，大多數成年裸鼠的結節在6個月后消失，有一只裸鼠雖產生腫瘤，但通過組織學和免疫組化驗證發現腫瘤自發形成，并非注射形成。將MDCK細胞裂解物和細胞DNA進行注射，雖然有動物產生腫瘤，但經檢測發現并非注射MDCK細胞裂解物及細胞DNA產生，系自發形成，從而證實MDCK 9B9-1E4是一株無成瘤細胞系，為了驗證其成瘤特性，后又插入H-ras基因和MMP14基因，這2種基因都可激活小鼠c-myc基因導致腫瘤形成，結果發現轉染的MDCK-Myc-Ras和MDCK-Src-MMP14在注射部位形成腫瘤，而MDCK 9B9-1E4未形成腫瘤[19]。因此，經過疫苗生產過程中物理過濾及化學純化，在每劑流感疫苗中MDCK細胞存在的概率為1/1034，概率極低，所以MDCK細胞基質的流感疫苗可認為是安全的。

4 展望

隨著經濟的發展和人們生活水平的提高，流感病毒的醫療防控日漸升級，流感疫苗的需求日益增加，基于雞胚的流感疫苗產業早已無法滿足大眾需求，因此，細胞基質的疫苗產業升級非常有必要。