海南黎藥血葉蘭的無菌播種及高效繁育技術初探

陳耀麗，尤燕平，鐘云芳，吳文蝶，陳英轉，楊澤秀，2

1.熱帶特色林木遺傳與種質創新教育部重點實驗室/海南大學林學院，海南海口 570228；

2.海南珠峰園林科技有限公司，海南海口 570220；

3.福建江南春城市建設集團有限公司，福建漳州363005

血葉蘭（Ludisia disclor）是蘭科血葉蘭屬草本植物，在中國主要分布福建、廣東、廣西、海南、云南南部、貴州等熱帶、亞熱帶地區[1]，在大洋洲的納土納群島和東南亞的泰國、馬來西亞、越南等地區也有少量分布[2]。血葉蘭匍匐生長，喜歡陰涼濕潤的環境，生長于陰涼濕潤的巖石上，它的根狀莖暗紅色，粗壯肥厚、肉質，具有比較明顯的莖節。葉片是倒卵形，暗紅色或暗紫色，具有清晰的葉脈網紋，具有較高的觀形觀葉價值[3]。血葉蘭具有味甘、性涼特性，其莖段和葉片用水煎服，可以滋陰潤肺，可以治療肺結核咳血、食欲不振[4]等癥狀，具有健脾安神的功效[5]，是海南傳統黎藥。在福建閩南地區，老百姓也推崇其藥用價值[6]，已經實現量產化，應用組織培養技術生產商品血葉蘭的模式不斷興起[7]。

血葉蘭種子由果莢包被，一個果莢含有上千粒種子，種子只有微小的胚，不含胚乳和子葉，在自然條件下種子自身缺乏養分，難以萌發和繁殖，通過組織培養技術進行蘭科植物種子無菌播種，誘導種胚萌發成苗，已經成為血葉蘭保育和繁殖的重要手段。近年來，由于血葉蘭的藥用價值不斷被挖掘出來，人為的干擾及破壞，導致血葉蘭野生資源瀕臨滅絕，國家已將血葉蘭列為二級保護植物。因此，研究野生血葉蘭的無菌播種及組織快繁技術，不僅可以有效的保護野生血葉蘭種質資源，也為量化生產商品血葉蘭提供技術支持。

國內外對血葉蘭的研究集中在開花物候及繁育[8]、內生菌共生[9]，生物學性狀研究[10]，種質資源保護[11]、人工引種馴化栽培[12]、有效成分分析[13]、藥用成分開發[14]，親緣關系分析[15-16]，組織培養[17-18]等方面。該研究在此基礎上，結合目前海南血葉蘭生產現狀，探索野生血葉蘭無菌播種和組織快速繁育技術，以期為推動海南血葉蘭產業化進程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

對生長在昌江霸王嶺自然保護區內的野生血葉蘭進行人工授粉，花粉結實后，當果莢生長成熟度達到85%，還沒有開裂時，將果莢采下后，用酒精進行表面消毒保存，開展離體播種實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子萌發誘導

采回來的血葉蘭果莢，用毛筆刷洗果莢表面后，在洗衣液中浸泡10min，然后無菌水搖晃沖洗干凈后，用脫脂棉吸干表面水分，轉移到消毒殺菌的超凈工作臺上進行播種。用75%的酒精浸泡血葉蘭果莢30s 后，用無菌水清洗兩遍，再用有效氯含量為0.8%的次氯酸鈉溶液消毒5min～8min，期間不斷搖晃瓶子，用無菌水沖洗5 遍～7 遍，風干表面水分后。將果莢放置在經高溫消毒的濾紙上，切開血葉蘭果莢，將種子均勻散播到到不同培養基中。該種子萌發誘導實驗中，使用花寶1 號、KC、1/2MS 培養基作為基礎培養基，分別添加20g/L 的土豆和100mL 的椰汁等有機物，具體的培養基配方見表1。

表1 誘導血葉蘭種子萌發的添加土豆和椰汁的不同培養基Tab.1 Formulas of Ludisia discolor Seeding Medium with Potato and Coconut Juice

血葉蘭種子播種后，先暗培養7d，再將播種后的種子轉到25℃的培養室，培養的光強是1500lx～2000lx，每天的光照時間是12h～14h。培養60d 后，記錄血葉蘭種子萌動時間，統計發芽率。

1.2.2 根狀莖分化誘導

血葉蘭種子萌發后，產生白色絮狀根毛和原球莖。將原球莖轉接到添加不同花寶種類的1/2MS 培養基中，每1L 培養基中均添加蔗糖20g、添加瓊脂7g/L、添加活性炭1g，調節培養基的pH 值為5.8～6.0。具體的培養基配方見表2，每個配方重復3 次，每次重復接種10 個，正常光照培養45d 后，統計血葉蘭根狀莖的誘導分化率。

表2 誘導血葉蘭根狀莖分化的添加不同花寶的培養基Tab.2 Formulas of Ludisia discolor Rhizome Induction Medium

1.2.3 血葉蘭根狀莖增殖培養

以1/2MS 作為基本培養基，每升培養基中添加20g/L 蔗糖、7g/L 瓊脂和1g/L 活性炭，激動素（KT）設置4 種不同濃度，分裂素（NAA）設置3 種不同濃度，設置12 組不同的激素配比，KT 和NAA 的濃度組合見表3。每個激素組合的配方接種10 瓶，每瓶接種5 個血葉蘭根狀莖，培養60d 后統計血葉蘭根狀莖叢芽增殖情況。

表3 添加不同激素的誘導血葉蘭根狀莖叢芽增殖培養基Tab.3 Formulas of Ludisia discolor Rhizome Proliferation Medium

1.2.4 壯苗生根培養

選擇已經長出3 片葉子，長勢相對一致的血葉蘭無菌苗，探索不同濃度的吲哚丁酸(IBA)和不同濃度的萘乙酸(NAA)組合在一起對血葉蘭無菌苗長勢和生根的影響。IBA 和NAA 均設置3 個不同梯度濃度，以1/2MS 作為基本培養基，在培養基中添加不同濃度的IBA 和NAA 等生長調節劑，兩種激素的濃度如表4 所示。每種生根培養基轉接30 株血葉蘭增殖苗。經過60d 的培養，統計血葉蘭生根和株高情況。

表4 血葉蘭壯苗生根培養基添加的激素種類和濃度Tab.4 Additions of Ludisia discolor Strenthening Shoot and Rooting Medium

2 結果與分析

2.1 種子萌發誘導

血葉蘭種子在所有處理組上都可以萌發，其種子萌發的時間和萌芽率結果有較大差異，種子萌發整齊度也不一致。血葉蘭種子萌動的時間、萌芽率和萌發生長狀態見表5。

表5 添加不同有機物的培養基對血葉蘭種子萌發的影響Tab.5 Results of Seed Germination on Different Medium

從表5 中可以看出，在萌發時間上，血葉蘭種子在添加了土豆的KC 培養基上萌動最快，時間最短，只有20d，萌動時間明顯短于其他培養基。在添加椰汁的1/2MS 的培養基中萌發最慢，萌發時間最長，為88d。在血葉蘭種子萌芽率方面，在KC 培養基添加土豆有機物能顯著促進血葉蘭種子萌發，萌芽率為88.44%，顯著高于其他5 種培養基。而1/2 MS+椰汁的培養基對血葉蘭種子萌發的促進作用最小，只有11.66%，顯著低于其他培養基。

血葉蘭種子的萌發速度在添加土豆汁和椰子汁的實驗處理中的萌發速度如下：KC+土豆＞花寶1號+土豆＞花寶1 號+椰汁＞KC+椰汁＞1/2 MS+土豆＞1/2 MS+椰汁的培養基。

血葉蘭在各培養基中的萌芽率是，KC+土豆＞KC+椰汁＞花寶1 號+土豆＞1/2 MS+土豆＞花寶1 號+椰汁＞1/2 MS+椰汁。

綜合血葉蘭種子在各培養基中的萌發速度和萌發率，優選出在誘導血葉蘭種子萌發的培養基是：KC+20g/L 土豆+20g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂+1.0g/L 活性炭。

圖1 血葉蘭種子萌動圖（A、B：種胚膨大；C、D、E：種胚變大，突破種皮，出現白色絮狀根毛；F：分化出分生組織）Fig.1 Ludisia discolor Seed Germinated (A-B：Seed Embryo Swell；C-E：Continued Embryo Enlargement,Testa Ruptured，Rhizoids Present；F：Appearance of Protomeristem)

2.2 1/2MS 基礎培養基添加不同型號的花寶對血葉蘭根狀莖分化的影響

從表6 中可以看出，添加不同花寶的1/2 MS 培養基均能誘導血葉蘭根狀莖分化，在不同培養基中，均能觀察到血葉蘭莖段表面長滿白色的根毛絮狀物（見圖2-A）。血葉蘭種子在培養基中培養10d 后，發現所有處理組的根狀莖的頂端陸續分化出白色緊湊的芽點，說明所有添加花寶的處理均能使血葉蘭根狀莖分化發芽。實驗結果表明，在誘導血葉蘭根狀莖分化發芽方面，添加了花寶4 號的1/2MS 培養基對血葉蘭根狀莖影響最大，誘導率顯著高于其他添加花寶的處理組，為98.3%。在1/2MS 中添加不同花寶的培養基，對血葉蘭根狀莖分化的誘導率的先后順序是，1/2MS+花寶4 號＞1/2MS+花寶1 號＞1/2MS+花寶2 號＞1/2MS+花寶5 號＞1/2MS+花寶3 號。

圖2 血葉蘭根狀莖誘導發芽Fig.2 The Rhizome Bud Induction

表6 1/2MS 培養基添加不同花寶誘導血葉蘭根狀莖分化情況Tab.6 Results of Rhizome Induction on Different Medium

在生長勢方面，血葉蘭在添加花寶4 號的1/2MS 培養基中的長勢最好，優于其他培養基，其優先順序為：1/2MS+花寶4 號>1/2MS+花寶1 號=1/2MS+花寶2 號>1/2MS+花寶5 號=1/2MS+花寶3 號。

2.3 不同激素配比對血葉蘭根狀莖叢生芽增殖的影響

根據表7 可知，以1/2 MS 作為基礎培養基，添加不同濃度的KT 和NAA，可以誘導血葉蘭根狀莖叢生芽增殖，增殖苗的狀態較佳。實驗結果表明，在KT 濃度分別固定在1.0mg/L 和3.0mg/L 時，當NAA的濃度從0.1mg/L 逐漸遞增到0.5mg/L 時，血葉蘭的根狀莖叢生芽數量呈現先增多后減少的趨勢。當NAA 的濃度在0.3mg/L 時，叢生芽的增殖系數達到頂峰值。當兩種激素的濃度是3.0mg/L KT+0.3mg/L NAA 時，血葉蘭根狀莖誘導的叢生芽的數量最多，生長勢較佳。當KT 的濃度為5.0mg/L 時，隨著NAA 濃度的增加，血葉蘭叢生芽增殖系數減少，但莖段之間的增殖倍數差異不顯著。

表7 血葉蘭叢生芽不同激素種類和濃度的培養基誘導增殖情況Tab.7 Results of 1/2MS with Different Hormones to induce Ludisia Discolor Multipropagation

當NAA 濃度是0.1mg/L 和0.5mg/L 時，血葉蘭的叢芽數量隨著KT 濃度的增加而增加，但差異并不顯著。當NAA 是0.3mg/L 時，隨著KT 濃度的增加，血葉蘭的根狀莖叢芽增殖系數先增加，然后減少，且顯著較差異，說明KT 的濃度對血葉蘭根狀莖叢生芽增殖誘導影響比較大。

圖3 血葉蘭根狀莖叢生芽誘導增殖Fig.3 The Rhizome Bud Micropropagation

2.4 不同激素的培養基對血葉蘭壯苗生根的影響

將有3 片真葉的血葉蘭無菌苗接種在同時添加不同濃度的IBA 和NAA 的1/2MS 基礎培養基中，培養20d 后，血葉蘭無菌苗根狀莖基部開始萌動突起，出現乳白色的根毛，且逐漸長出新葉。培養45d 左右，血葉蘭葉片展開長大，根莖粗壯，根毛茂盛，60d后統計生根數量。

圖4 血葉蘭無菌苗壯苗生根Fig.4 Shoots Strengthening and Roots Induction of Ludisai Discolor

從表8 中可以看出，IBA 和NAA 組合在一起時，能夠促進血葉蘭壯苗和生根。當NAA 濃度一定時，將IBA 濃度由0.1 mg/L 增加到0.5 mg/L 時，血葉蘭的株高隨著IBA 濃度的增加而明顯升高，當IBA 濃度由0.5 mg/L 增加到1.0 mg/L 時，血葉蘭的株高隨著IBA 濃度的增加而逐漸減少，說明當IBA 的濃度小于等于0.5 mg/L，IBA 能促進血葉蘭的生長，而IBA 濃度≥0.5 mg/L，血葉蘭的生長狀態隨著IBA濃度的增加而減弱，說明高濃度的IBA 和低濃度的NAA 混合配比時，能使血葉蘭的生長和生根得到抑制。因此，血葉蘭最適的生長和生根培養基是1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+5%香蕉+20g/L蔗糖+7g/L 瓊脂。

表8 1/2MS 培養基添加不同濃度的IBA 和NAA 對血葉蘭壯苗生根的影響Tab.8 Resules of Different Medium inducting Ludisia discolor Rooting

3 討論

有很多種培養基可以誘導血葉蘭種子離體萌發，如VW、KC、花寶系列、1/2MS 和MS 培養基等。該研究中比較了添加土豆和椰汁的KC、1/2MS、花寶1號等三種不同的培養基對血葉蘭種子萌發的影響。研究表明，血葉蘭在添加了土豆KC 培養基上萌發最快，添加土豆的花寶1 號次之，添加土豆的1/2MS培養基萌發最慢。而李宏楊[18]的研究結果顯示，血葉蘭種子在1/2MS 和花寶1 號萌發時間差不多。出現差異的原因有可能是，在該研究中，筆者在1/2MS 和花寶1 號培養基中添加了土豆和椰汁等有機物質，有機物與基本培養基的相互作用影響了種子養分的吸收[19]。另外，血葉蘭種子的萌發也會受到種子來源、種子活力、培養溫度、光照、濕度等條件的影響。在開展研究工作時，需要嘗試幾種不同的培養基，才能選擇出合適的誘導血葉蘭種子萌發的培養基。廖紅英、劉雅舒、高壯壯等通過在培養基中添加花寶1號和花寶2 號，成功誘導德氏兜蘭的原球莖和蝴蝶蘭不定芽增殖分化[20-21]，誘導墨蘭根狀莖的分化及生長[22]，這與該研究中不同的花寶種類成功誘導血葉蘭根狀莖分化的結果一致，而在研究中，以花寶4號對血葉蘭根狀莖分化誘導率最高，且長勢最好，這可能與花寶4 號的N、P、K 比例有關，較適宜促進根狀莖新芽和根的分化有關。

血葉蘭在不同的根狀莖分化、叢芽增殖培養等生長階段需要不同的種類和不同濃度的激素。蘇建睦[20]在研究6BA，NAA，TDZ 等三種激素對血葉蘭叢芽增殖的研究中發現，在MS 培養基中添加高濃度的6-BA 和低濃度的NAA、TDZ 時，可以促進血葉蘭根狀莖叢芽增殖，增殖系數達到4.92。朱橋的研究結果發現[23]，最適宜血葉蘭根狀莖叢生芽增殖的培養基為1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+15%香蕉汁，叢芽增殖系數達到4.83。在該研究中，篩選出最適宜誘導血葉蘭根狀莖叢芽生長的培養基是1/2MS+3.0mg/L KT+0.3mg/L NAA+20g/L 蔗糖+1g/L 活性炭+7g/L 瓊脂，叢芽長勢較好，增殖系數達到5.05。這與王高鵬使用1.5mg/L KT+0.5mg/L NAA 誘導白芨增殖的方法相似[24]。

植物生長調節劑IBA、NAA 對壯苗生根起到重要作用，蘇建睦的研究結果表明，最適宜血葉蘭壯苗生根的培養基是0.5mg/L NAA+1.6mg/IBA+15%香蕉，生根率達到93.0%[17]。在血葉蘭壯苗生根實驗中，使用適宜濃度的IBA 和NAA，同時配合使用有機添加物香蕉，植株生長旺盛，可以大幅提高生根率，生根效果好。該研究表明，在血葉蘭無菌苗壯苗生根時，使用1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+50g/L 香蕉+20g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂的配方，能夠顯著促進血葉蘭生長、生根和苗的質量，生根率達到100%。