土沉香優勢結香真菌分離篩選及鑒定

陳彧，周國英，彭江濤，董曉娜，饒丹丹，韓豫

1.海南省林業科學研究院(海南省紅樹林研究院)，海南海口 571100；

2.中南林業科技大學生命科學與技術學院，湖南長沙410004

土沉香(Aquilaria sinensis)，又名白木香、女兒香、莞香、崖香，為瑞香科沉香屬植物，國家二級重點保護野生植物[1-2]，是中國名貴芳香類藥材沉香的唯一植物來源[3]，主產于海南、廣西、廣東、福建、臺灣等省份及香港特別行政區。健康的土沉香植株，在人為或者自然方式脅迫條件下樹干木材組織發生的生物化學防御反應，導致酯類物質逐漸增多的過程稱為結香，形成的樹脂的木塊為沉香[4]。沉香因具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等藥用功效[5]，在亞洲、中東和歐洲被廣泛用于醫藥。同時沉香具有獨特的香味，也是一種傳承歷史悠久的名貴香料，品質好的沉香在市場上甚至可以賣到上萬元或者幾萬元的價格，被稱為“香中的鉆石”[6-7]。隨著沉香市場價格走高，土沉香的野生資源被人為濫伐，導致野生資源破壞。為了保護野生沉香資源，同時增加沉香產量，中國海南、廣東、臺灣、福建、廣西等地開始了廣泛的土沉香培育及促進土沉香結香技術研發工作。目前關于土沉香的結香機制，國內外學者開展了大量研究[8-16]，無統一標準，但是大多數認為土沉香結香與真菌侵染有關。目前從土沉香植物結香部位分離出的內生真菌主要有黃綠墨耳菌(Melanotus flavolivens)、鐮刀菌(Fusarium)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、曲霉(Aspergillus)、磚紅鐮孢(Fusarium laseritum)、青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)、木霉(Trichoderma)、裂褶菌(Schizophyllum)、刺盤抱菌(Colletotrichum)等。但是關于是否促進土沉香結香還存在爭議。該研究采用平板組織分離法從土沉香已結香部位分離內生真菌；選用沉香主要成分芐基丙酮篩選耐藥性強的內生真菌；通過輸液人工造香法測定內生真菌侵染力及促進結香研究，為后續高效生物復合結香誘導劑的研制及其應用奠定良好的基礎，為沉香產業可持續性發展提供科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自海南省海口市瓊山區云龍鎮海南省林業科學研究院（海南省紅樹林研究院）云龍科研基地（19°52′N，110°28′E）10 年生土沉香在人工創傷2 年自然結香木塊。沉香樣品采集后于48h內進行表面消毒。

1.2 供試培養基

PDA 培養基：將馬鈴薯刮去表皮，切成大小基本一致的小塊，稱取200g 去皮后的馬鈴薯小塊，放入電磁爐中煮，煮至可用玻璃棒輕輕戳爛，之后用紗布過濾得到馬鈴薯濾液，往濾液中加入葡萄糖20g、瓊脂20g，最后加蒸餾水定容至1L。PDB 培養基中不需要添加瓊脂。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

利用已經消毒的生長錐進行取樣。取樣部位表面采用75%酒精進行消毒，取樣后立即放入滅菌袋中，儲藏運輸。在進行下一次取樣之前，生長錐用75%酒精和無菌水滅菌，最后用無菌濾紙擦拭。

1.3.2 內生真菌分離純化

樣品表面消毒，依次使用無菌水沖洗樣品表面3 次，沖洗完之后將樣品用滅菌好的鑷子夾入75%酒精中自然漂洗30s，漂洗過后在反復使用無菌水沖洗樣品表面3 次，沖洗完之后在將樣品放入升汞中自然浸泡3min，最后在使用無菌水反復沖洗4 次；吸取最后處理樣本的無菌水沖洗液涂布于完全培養基中作為相應的對照培養。若培養后出現菌落，則說明樣品表面消毒不徹底。

樣品表面消毒完成后，采用組織分離法用無菌刀片切去表面材料，將樣品的結香部分均切成小塊，將樣品對稱放置于含鏈霉素(50U/mL) 的PDA 平板上，恒溫箱中28℃培養。待有菌落形成后，使用菌絲尖端挑取法，將長出的菌落菌絲體轉接至新的PDA平板上，重復純化3 次～4 次直至獲得純培養的菌株。

1.3.3 內生真菌分子鑒定

使用真菌基因組DNA 提取試劑盒，提取篩選出來的內生真菌DNA，利用真菌ITS 通用引物對從白木香中分離得到的內生真菌基因組進行PCR 擴增；初步了解內生真菌的分類地位。

1.3.4 促結香真菌篩選

（1）耐藥性優勢菌株篩選

配制PDA 培養基，待培養基冷卻到50℃～60℃，往培養基里滴加2 滴0.10%吐溫-80 作為乳化劑，加入沉香主要成分之一的芐基丙酮，快速混勻后倒平板，配置成體積分數為0.05%濃度的芐基丙酮培養基。用6mm 的打孔器在接有活化好的內生真菌的PDA 平板上打出直徑約為6mm 的圓形菌餅，然后用滅菌接種針各挑取1 塊圓形菌餅置于含芐基丙酮的培養基平板中央，同時以置于不含芐基酮的空白處理，每個處理和對照均設置3 次重復，置于26℃下恒溫避光培養4d 后，觀察真菌的生長狀況，計算芐基丙酮對菌株的抑制率，選取對耐受能力較強的菌株進行下一步復篩。

（2）促結香真菌復篩

將分離出來并初步鑒定的內生真菌接種到PDB培養基中，28℃、180r/min 搖床培養7d～9d，液體培養物經慢速過濾得到孢子懸浮液備用。在8 年生土沉香植株高80cm 處用直徑0.8cm 電鉆打孔，采用輸液法將發酵液注射入樹體中，每個樹體注入200ml發酵液。將孢子懸浮液接種到8 年生土沉香樹上，每個菌種接種3 棵樹，三個月后觀察樹體注射孔顏色變化，并采取部分材料進行燃燒，觀察燃燒情況，根據燃燒香味，初步篩選優勢結香真菌。

1.3.5 促結香真菌分子鑒定

由于單基因鑒定對親緣關系較近的物種分辨率較低，鑒定誤差也相對較高；因此針對促結香真菌，采用多基因進行聯合鑒定，以確保鑒定的準確性。針對鐮刀菌屬促結香真菌，利用ITS、TEF、histone H3三基因進行PCR 擴增與鑒定；利用ITS、β-tub、RPB2 三基因對毛色二孢屬的促結香真菌進行擴增和鑒定（引物序列、PCR 反應程序及體系見表1、表2），委托湖南某公司完成PCR 產物測序。將測序結果在NCBI 數據庫中blast，在Gen Bank 數據庫中下載同源性高的基因序列，利用mafft 軟件進行比后，在SequenceMatrix 軟件中進行多基因序列的連接，最后在MEGA 7.0 軟件中構建系統發育進化樹，從而確定篩選的促結香真菌分類地位。

表1 基因引物序列及PCR 反應程序Tab.1 Gene Primer Sequence and PCR Reaction Program

表2 PCR 反應體系Tab.2 The PCR Reaction System

2 結果與分析

2.1 內生真菌分離及鑒定

通過組織分離方法，共從土沉香結香木質部中分離純化出34 株內生真菌，根據ITS 單基因測序鑒定結果，可以初步分為10 個屬（鐮刀菌屬Fusarium、毛色二孢屬Lasiodiplodia、間座殼屬Diaporthe、Crassiparies、棒束孢屬Isaria、擬莖點霉屬Phomopsis、格孢腔屬Pleosporales sp、輪層炭菌屬Daldinia、環紋炭團菌屬Annulohypoxylon、炭團菌屬Hypoxylon），其中鐮刀菌屬4 個種共15 株占比44.11%、毛色二孢屬2 個種共7 株占20.58%、輪層炭菌屬2 個種5株占14.7%、Hypoxylon2 個種2 株占5.88%。

2.2 促結香真菌篩選結果

2.2.1 耐藥性優勢菌株篩選

將分離篩選的34 株內生真菌，分別接種在含有芐基丙酮（體積分數0.05%）的PDA 培養基上，同時接種在空白的PDA 培養基上，3 次重復（結果見表3）。從表3 可以得出，芐基丙酮對所分離的內生菌株均有一定程度的抑制作用，其中CX-3-2 的抑制率最低，為33.76%，該菌株的耐芐基丙酮的能力最強，CX-3 等15 個菌株的抑制率低于60%，具有一定的耐藥性，初步入圍耐藥性優勢菌株，主要為鐮刀菌屬和毛色二孢菌屬真菌。

表3 優勢耐藥內生菌株耐芐基丙酮效果Tab.3 The Effect of Endogenous Fungi Resistant to Benzyl Acetone

注：菌落直徑大小為3 次重復平均值，抑制率（%）=（對照菌落直徑—處理菌落直徑）*100/（對照處理直徑-6）；同行中的“**”標示在P＜0.01 水平差異顯著。

2.2.2 促結香真菌復篩

將2.2.1 初步篩選的15 株優勢耐藥內生菌孢子懸浮液接種到8 年生土沉香樹上，每個菌種接種3 棵樹。接種后三個月后，用砍刀將菌種發酵液注射孔及其周圍的表皮去掉后，部分處理肉眼觀察發現孔洞周圍的木質部已經發黑變色，變色方向主要是向兩端縱向延伸（圖1），能引起樹體接種口顏色變化的內生真菌分別屬于鐮刀菌屬和毛色二孢菌屬真菌CX-1-1、CX-G-3-2、CX-1-2、CX-G-2-2、CX-1-5和CX-C3-1。因此選定CX-1-1、CX-G-3-2、CX-1-2、CX-G-2-2、CX-1-5 和CX-C3-1。將取出的黑色木塊組織肉眼觀察無腐化爛木現象，且經燃燒試驗后無異味黑煙，而是白色帶有淡香的煙氣。初步認為，變色樹脂部分為沉香，所篩選的耐藥菌可以促進結香。

圖1 菌液對土沉香樹體結香影響（A：注射菌液；B：侵染能力調查；C：注射孔顏色變化）Fig.1 Fungal Inoculation induces Agarwood in Aquilaria sinensis（A：Fungal Inoculation，B：Infection Investigation，C：Injection Hole Color Changes）

2.3 促結香真菌分子鑒定結果

將鐮刀菌屬真菌的三基因序列進行Nu-cleotide Blast 分析，結果顯示CX-1-1 的ITS、TEF、histone H3 三基因分別與Genbank 登錄號MT529824.1、MN386735.1、MK482251.1 均具有99%的同源性，CX-1-2ITS 基因與 Genbank 登錄號MN871563.1 具有99%同源性，TEF 基因與Genbank登錄號JQ412106.1 具有100%同源性，histone H3基因與Genbank 登錄號KX681550.1 具有99%同源性；CX-G-2-2 的ITS 基因與Genbank 登錄號MT509801.1 具有100%同源性，TEF 和histone H3基因分別與 Genbank 登錄號 MK414218.1 和GU737427.1 均具有99%同源性；CX-G-3-2 的ITS 和TEF 基因分別與Genbank 登錄號MF281192.1 和KC820964.1 均具有98%同源性，histone H3 基因與Genbank 登錄號KM231522.1 具有100%同源性。如圖2，CX-1-1 與Fusarium oxysporum、CX-1-2 與Fusarium fujikuroi、CX-G-2-2 與Fusarium proliferatum 和CX-G-3-2 與Fusarium solani 均聚在同一支，并且支持率分別為100%、95%、91%和100%。結合形態學特征可以將菌株分別鑒定為CX-1-1 為Fusarium oxysporum（尖孢鐮刀菌）、CX-1-2 為Fusarium fujikuroi（藤倉鐮刀菌）、CX-G-2-2 為Fusarium proliferatum（層出鐮刀菌）、CX-G-3-2 為Fusarium solani（腐皮鐮刀菌）。

圖2 鐮刀菌屬三基因系統發育樹Fig.2 Phylogenetic Tree Obtained from Combined Sequence Data of ITS，TEF and Histone H3 Gene Regions and Generated from Maximum Likelihood Analysis of Fusarium

毛色二孢屬真菌三基因blast 結果顯示：CX-1-5 的ITS、β-TUB 和RPB2 三基因分別與Genbank 登錄號MN887200.1、MN867365.1 和MF410182.1 均具有100%同源性；CX-C3-1 的ITS 和RPB2 基因分別與 Genbank 登錄號 MH644067.1 和XM_035516989.1 均具有99%同源性，β-TUB 基因與Genbank 登錄號MG813976.1 具有98%同源性；如圖3 所示，CX-1-5 與 Lasiodiplodia pseudotheobromae聚在同一分支，并且支持率有99%，CX-C3-1 與Lasiodiplodia theobromae 有97%的支持率聚在同一分支上；結合形態特征可將CX-1-5 鑒定為Lasiodiplodia pseudotheobromae（假可可毛色二孢）、CX-C3-1鑒定為Lasiodiplodia theobromae（可可毛色二孢）。

圖3 毛色二孢屬三基因系統發育樹Fig.3 Phylogenetic Tree Obtained from Combined Sequence Data of ITS，β-TUB and RPB2 Gene Regions and Generated from Maximum Likelihood Analysis of Diospora

3 結論與討論

3.1 結論

采用平板組織分離法從土沉香結香部位分離內生真菌，通過沉香主要成分芐基丙酮耐藥性初篩及打洞輸液法結香復篩土沉香優勢結香真菌，并進行分子鑒定。從已結香的土沉香木質部中初步分離出內生真菌34 株，通過形態學及ITS 分子初步鑒定歸于7 目7 科10 屬，其中鐮刀菌屬（Fusarium）為優勢屬，其次為毛色二孢屬（Lasiodiplodia）。經芐基丙酮耐藥性及人工造香復篩，篩選出6 種優勢促結香真菌，鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、假可可（毛色二孢Lasiodiplodia pseudotheobromae）、可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）。

3.2 討論

內生真菌普遍存在于植物中，內生真菌的種類和數量與植物種類、生長環境、分離方法密切相關。該研究從已結香的沉香木質部中初步分離出內生真菌34 株，通過形態學及ITS 分子初步鑒定歸于7 目7 科10 屬，其中鐮刀菌屬為優勢屬，其次為毛色二孢屬。張秀環等[17]從樹齡為7a 的白木香健康部位和樹脂形成部位共分離出42 株內生真菌，還發現枝頂孢霉屬為健康部位優勢菌屬，青霉屬為結香部位優勢菌屬，而Gong[18]和王磊[19]、黃秋偉[20]等人研究均發現白木香結香部位中優勢屬為鐮刀菌屬，馬華明[21]通過對比土沉香創傷組和結香組真菌種類差異，認為括多變根毛霉（Rhizomucor variabilis）、再育鐮刀菌（Fusarium proliferatum）和哈茨木霉（Hypocrea lixii），能促進沉香的形成。該研究結果與前人分離真菌結論有差異也有相似之處，這可能與樣品的所處地域環境不同，該研究樣品來自土沉香原生地-海南，屬于潮濕溫暖熱帶地區，微生物多樣性更豐富，或者是環境條件這些外在因素影響了內生真菌的侵染和多樣性，進一步驗證沉香的形成是多種真菌復合作用的結果。

內生真菌與植株形成了互惠互利的共生關系，不但可以自身合成與宿主植物相似活性成分，還具有促進宿主植物合成活性成分的能力[22]。芐基丙酮是沉香芳香族化合物的代表性活性成分，對于促進結香的內生真菌首先在一定程度上對沉香活性成分具有耐受性[20]。該研究通過沉香主要成分芐基丙酮耐藥性及人工造香篩選，篩選出6 株優勢促結香真菌，經形態學及多基因系列分子鑒定為尖孢鐮刀菌、藤倉鐮刀菌、層出鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、假可可毛色二孢、可可毛色二孢。Tabata 等人[23]研究發現5 種鐮刀菌均能促使白木香結香。陳旭玉等人[24]研究發現沉香木中優勢菌種為可可毛色二孢菌，在可可毛色二孢菌的發酵液中檢測到茉莉酸類物質，并且白木香愈傷組織在被其發酵液處理過后，可以檢測出3 種倍半萜物質[25]。腐皮鐮刀菌與白木香粉末進行固體發酵，經過波譜分析鑒定出了7 種沉香的有效成分，腐皮鐮刀菌的發酵液也可以誘導白木香產生倍半萜物質[26]，并且在大米上進行發酵后，其發酵產物中含有脂肪烴類、甾體類和鐮紅菌素類[27]。尖孢鐮刀菌的發酵液中會含有一種抗腫瘤的吲哚生物堿長春新堿和纖維素酶[28-29]。因此可推測在多種真菌的作用下，真菌和其發酵液產物對促進白木香結香均具有一定的作用，為下一步生物復合結香誘導劑的研制奠定基礎。