中性粒細胞胞外網狀陷阱（NETs）在肺栓塞中的研究進展

錢鴛鴛 余 釗

中性粒細胞胞外網狀陷阱（NETs）是由DNA 和組蛋白為骨架而形成的網狀結構，以染色質解聚和核顆粒物質釋放為主要特征。它作為中性粒細胞殺菌的第二種機制，在多種感染性疾病、自身免疫性疾病及心血管疾病中發揮重要作用[1]。NETs 可通過血小板、紅細胞和促凝血因子（如血管性血友病因子）促進血栓形成[2]，也可以通過NETs 組份如無細胞DNA（cfDNA）、髓過氧化物酶（MPO-DNA）復合物等激活內源性凝血途徑，促進敗血癥、小血管炎、靜脈栓塞等發生發展，造成嚴重組織損傷[3]。有動物實驗顯示，NETs 的特征性細胞外DNA 纖維結構大量存在于小鼠誘導產生的靜脈血栓形成中[4]。而近期NETs 在靜脈血栓中的作用也逐漸被廣泛關注[5]。本文結合近年來NETs 相關基礎及臨床研究文獻，圍繞NETs 在靜脈血栓形成及肺栓塞中的作用綜述如下。

1 NETs

NETs 是中性粒細胞的一種新型殺菌方式，主要通過中性粒細胞激活后釋放到胞外，是由DNA 和組蛋白為骨架，中性粒細胞彈力蛋白酶（NE）、MPO、α防御素、抑菌肽LL-37、組織蛋白酶等組成的帶有強大負電荷的網狀結構，以捕獲并殺滅病原微生物。是一種“自殺式”的消滅病原微生物的防御模式，而形成NETs 的過程稱為NETosis[6]。NETs 的形成是壞死或細胞凋亡死亡的替代方法。該方式通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶及Raf-MEKERK 途徑使中性粒細胞發生染色質伸展，解凝聚，核膜崩解釋放DNA、殺菌顆粒等并黏附于解凝聚的染色質上，進而核膜破裂，中性粒細胞死亡，釋放NETs。NETs 不僅可以捕獲病原體，還可以結合血小板和紅細胞，與靜脈血栓形成有著密切聯系。另外，NETosis 和凝血之間也有聯系，主要是因為NETs 上的NE，通過裂解使組織因子（TF）通路抑制劑（TFPI）失活，從而導致促凝活性增加。促凝活性導致血小板活化，活化的血小板可以增強NET 形成[7]。NETs 表現為“雙刃劍”的角色，在多數情況下，NETs 的產生對機體固有免疫是有益處的，如能在感染性疾病中防止病原微生物的擴散和起殺滅作用。但最近有研究發現NETs 同樣參與人體多種疾病的病理過程，當NETs 生成時會產生大量的自身抗原，若清除不及時，抗原大量堆積，可能誘導機體產生大量的自身抗體，造成自身免疫性疾病[8]。

2 NETs 在靜脈血栓形成及肺栓塞中的作用

2.1 靜脈血栓形成 血栓形成有三個因素，即血流淤滯、高凝狀態及血管血皮損傷，與炎癥和感染密切相關；而NETs 是炎癥和血栓形成之間的橋梁。血流淤滯由于血管擴張、炎癥滲出，使血流減慢，有利于炎癥介質和炎細胞聚集引起炎癥刺激。靜脈血流異常后激活內皮細胞，并與血小板、中性粒細胞和單核細胞協同作用，在完整的靜脈內傳播血栓[9]。中性粒細胞募集到靜脈壁后會被激活形成NETs[3]。NETs 的形成一方面是由于中性粒細胞-血小板間的相互作用，另一方面是因為NETs 激活內源性凝血途徑，使其獨立于纖維蛋白網絡中黏附血小板和紅細胞的支架[10]。有研究表明，NETs 可誘導內皮屏障功能障礙并將細胞外固體（ECs）轉化為血漿蛋白C 激活物（PCA），從而加劇血栓形成NETs[11]。NETs 通過TF 與凝血因子結合來促進促凝血活性。還可以通過Toll樣受體激活炎癥，觸發靜脈血栓形成[12]。由此可見，NETs 與靜脈血栓的形成密切相關[13]。

2.2 肺栓塞 肺栓塞是來自靜脈系統或右心的血栓栓子阻塞肺動脈或其分支導致急性呼吸和循環障礙的疾病[14]。因肺栓塞的栓子99%為血栓性狀，故肺栓塞栓子主要是血栓。肺栓塞的病因是任何可以導致靜脈血液淤滯、高凝狀態及血管血皮損傷，即血栓形成的三大因素。雖然關于NETs 參與肺栓塞的機制研究尚不完全清楚，但NETs 參與血栓形成的研究近期較為關注，且卓有成效。NETs 與靜脈血栓的形成密切相關[13]，進一步可以推斷肺栓塞與NETs 也是密切相關的。綜上所述，NETs 同樣與肺栓塞形成密切相關，但仍需要大量試驗證明。而抑制NETs 的形成可減少血栓形成也將成為以后研究的重點，從而進一步減少栓子阻塞肺動脈及其分支的概率，降低肺栓塞的治病率。

3 NETs 對肺栓塞預測及預后的影響

血栓形成包括內源性激活及外源性激活。Von Bruhl 等[15]證明NETs 激活因子XII，導致內在途徑的激活。中性粒細胞激活時可增加TF 的產生，并且NETs 還含有絲氨酸蛋白酶（中性粒細胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G），這會導致組織因子途徑抑制劑（TFPI）的蛋白水解失活并促進凝血酶和纖維蛋白凝塊的產生。因此，NETs 影響凝血系統的多個方面，導致血栓形成增加。此外，Stavrou 等[16]證明了阻斷凝血因子Xll-尿激酶受體（FXII-uPAR）與尿激酶受體（uPAR）肽的相互作用或使用特定的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2（AKT2）抑制劑可顯著降低NETosis。而Savchenko 等[17]發現NET 組件，包括H3Cit，主要定位于組織血栓，支持NET 在靜脈血栓形成和穩定中的作用。臨床研究證明，在過去十年中中性粒細胞成為靜脈和動脈血栓形成和進展的重要貢獻者，最有可能是通過釋放NETs。即與NETs 相關的循環標志物水平可能有助于血栓性疾病的診斷和預后。抑制NETs 形成可以進一步降低血栓形成，NETs 的分解和降解可以增強溶栓作用，提供有希望的治療選擇。另外，通過在不影響止血的情況下減少促血栓形成因素，直接減少NETs 形成可能提供一種更安全的抗凝治療替代方案。NETs 可以通過循環中cfDNA 水平升高來檢測到，表明這種NETs 副產品可能用作診斷VTE 的生物標志物。然而，迄今為止，還沒有研究將NETs 或NETs 副產品作為診斷急性DVT 的生物標志物進行評估[18]。有實驗證明DVTs 和肺動脈栓塞有血小板和白細胞聚集的區域，這些區域也同樣富含細胞外DNA。建立合適的診斷DVT 的生物標記物非常有用，因為現在超聲診斷雖然是目前最好的診斷方法，但是有時仍然不可靠[19]。另外，Li 等研究顯示，在急性肺動脈栓塞患者中，NETs 和脫脂轉化酶（LPA）顯著升高，故有可能通過LPA-NETs 信號通路來作為治療靜脈血栓形成的靶點[20]。目前也有研究證明，NETs 相關產物如DNase，是降解DNA 的血清酶，包括DNase1 和DNase1 樣蛋白。若他們缺失，不管在血管創傷時，或是由無菌中性粒細胞增多癥或敗血癥引起的NETs 形成，都會致嚴重的后果，導致全身血管阻塞，器官衰竭和快速死亡。目前，重組DNase1已成功用于液化囊性纖維化（CF）痰液，NE 抑制劑已用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）。所以我們更好地理解參與NETs 誘導的分子和拆除它們的機制有可能成功地改變NETs 的致病潛力[21]。也有研究發現，血小板分泌的高遷移率族框1 蛋白（HMGB1）可促進NETs 形成的因子，它參與核小體穩定和基因表達。活化的血小板與中性粒細胞的附著可能使它們非常接近，以至于分泌的HMGB1 能夠通過RAGE、TLR2和TLR4 受體激活中性粒細胞，導致NETosis 的誘導。據報道，HMGB1 也存在于NETs 上，從而刺激巨噬細胞[22]。綜上所述，NETs 及其相關產物作為靜脈血栓形成或肺栓塞的標志物，能大大提高其的檢測率，并做到早期診斷，早期治療，從而降低死亡率，提高生活質量。另外，對于血栓或肺栓塞的抗凝治療，出血風險一直是最大的難題，不管是相對安全的利伐沙班或低分子肝素，但若是有減少NETs 或其產物的藥物，既不影響止血，又能很好地治療該疾病，并在早期就很好地識別并治療。

4 展 望

由于NETs 異質性強，對于其檢測有局限性。可通過蛋白質印跡法和ELISA 輔助鑒定NETs。但對于量化檢測尚不完善，需要不斷探索研究。在治療方面，有研究顯示DNase1、維生素D、靶向B 細胞藥物（利妥昔單抗）、補體系統等均可抑制NETs 的形成，因此靶向預防NETs 形成可能成為防止血栓的新方法。另外，通過檢測NETs 及其標志物如循環細胞外DNA、MPO 水平和NE 的血漿水平，可預測肺栓塞或靜脈血栓形成等疾病，做到早期診斷，早期治療，從而降低死亡率，提高生活質量。但上述研究結果大部分來自鼠類模型研究，其具有所有固有的局限性。我們仍需要對肺栓塞進行大量研究，特別是針對更精確治療、預測發生的新型標志物的研究。