益生菌在鹽堿養殖水體中調控作用的研究進展

趙度賓 李月紅 來琦芳 覃欽博

(1 吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118; 2 中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090; 3 湖南師范大學省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，長沙 410081)

近年來，隨著我國人口的增長以及淡水資源的減少，我國人均可利用水資源不足且遠低于世界水平，在此形勢下，有效開發和利用內陸、濱海地區蘊藏著的大量鹽堿水資源已經成為鹽堿水域地區解決淡水資源短缺、保證水產養殖健康可持續發展的一個重要途徑[1-2]。益生菌能調節pH、均衡藻相、改良鹽堿和抑制有害病菌，可用于全方位水質改良，在改良鹽堿養殖水體中具有重要作用。目前，益生菌在水產養殖中已得到廣泛應用，且已有較多相關報道，但其在鹽堿水體中應用較少[3]。本文綜述了能夠改良鹽堿水域水質的益生菌——光合細菌、乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等在鹽堿養殖水體調控作用方面的研究進展，旨在為鹽堿養殖水體的水質改良提供參考資料。

1 鹽堿養殖水體水質改良益生菌種類

在水質改良方面使用的益生菌主要有光合細菌、乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌等。

1.1 光合細菌

光合細菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一類光合色素為菌綠素，能進行不產氧光合作用的原核生物，主要分為紫色硫細菌(PB)、紫色非硫細菌(PNSB)、綠色絲狀菌(GFB)和綠色硫細菌(GSB)四大類。光合細菌富含生物活性物質和營養成分，如蛋白質、色素、輔酶Q 10(CoQ10)、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、聚羥基脂肪酸酯(PHA)，此外還含有80多種較高濃度的類胡蘿卜素[4-5]。在養殖水體中，光合細菌能夠提高溶解氧(DO)水平，去除氨氮、亞硝酸鹽(NO2--N)，高效降解水中的污染物，具有較強的凈水功能。劉福軍等[6]發現，PSB可提高水體中溶解氧、硝態氮(NO3--N)的質量濃度，降低亞硝態氮、銨態氮(NH4+-N)的質量濃度，對浮游動物無明顯影響。鄭耀通等[7]研究發現，固定化光合細菌對模擬池水中化學耗氧量(COD)的去除率為60%，對氨氮的去除率高達90%，DO增加約38%。張明磊等[8]發現，在重碳酸鹽水體中施用PSB后，NO2--N、NH4+-N質量濃度顯著降低，pH和總堿度(Alk)無明顯變化。

1.2 乳酸菌

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類可利用碳水化合物進行發酵，產生大量乙酸、乳酸等有機酸的無芽孢革蘭氏陽性菌。在代謝過程中，LAB利用有機碳的氮源發酵產生乙酸、乳酸等有機酸和亞硝酸鹽還原酶，可有效降低水體的pH、亞硝酸鹽含量和氨氮含量，增加溶解氧和透明度[9-11]。現已證明，施用適量的乳酸菌對調節水質、健康養殖有重要意義。夏巖石等[12]研究發現，人工接種乳酸菌Lact.1純培養液能有效降解亞硝酸鹽，乳酸菌培養液的pH隨著培養時間的推移呈下降趨勢。宋蓉等[13-14]的研究表明，在添加碳氮營養源的情況下施用干酪乳桿菌L821a，能在4 d內將水體中的亞硝酸鹽質量濃度由8.0 mg/L降至3.35 mg/L，此外，投加乳酸可促進水體的反硝化作用。

1.3 芽孢桿菌

芽孢桿菌(bacillus)是一類產生芽孢、無莢膜、大多數有運動能力、革蘭氏染色為陽性的需氧或兼性厭氧菌。在水產養殖中使用的主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)和蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)等[15-16]。將適量芽孢桿菌添加到飼料中進行投喂，可促進養殖對象生長，增強其免疫力。沈斌乾等[17]研究發現，飼料中添加(2～5)×108cfu/g的枯草芽孢桿菌B115，能促進青魚魚種生長，降低飼料系數(從1.7降至1.5)。飼料中添加枯草芽孢桿菌E221，能緩解尼羅羅非魚因高鹽脅迫產生的負面效應[18]。芽孢桿菌又能用作水質調節劑，抑制有害菌群增長繁殖，改良水質，凈化環境。羅毅志等[19]發現，當地衣芽孢桿菌分離株DSY002-2011在室外池塘的用量為1.35×105cfu/L時，池塘水體氨氮質量濃度較對照組降低了36%。

1.4 酵母菌

酵母菌(yeast)是一種結構簡單、能發酵糖類的兼性厭氧型單細胞真菌。在水產上應用的主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假絲酵母(Candidaalbicans)等[20]。酵母菌菌體中蛋白質含量高，用作飼料時可部分替代魚粉，同時富含多種必需氨基酸、維生素、礦物質和各種消化酶[21]。酵母菌可有效提高飼料原料的營養價值并降低其中的抗營養因子含量，如植酸、抗性淀粉等。經過加工的酵母培養物能增強水產動物的機體免疫力、抗氧化能力[22-23]。酵母菌發酵過程中所產生的有機酸可降低水體pH，可用于處理高濃度有機廢水，還可同化硝酸鹽，分解亞硝酸鹽，吸附重金屬離子。辛博等[24]研究發現，從漿水中分離出的酵母菌不但不產生亞硝酸鹽，還可降解亞硝酸鹽，在漿水發酵過程中接種酵母菌可使亞硝酸鹽含量明顯降低。此外，酵母菌可維持池塘生物群落多樣性和穩定性。

2 益生菌對鹽堿水體的改良作用

高pH、高鹽、高堿、主要離子比例失調以及水質類型繁多等是鹽堿水體的主要特點。與淡水不同，在鹽堿水體中，鈉、鉀離子含量遠高于鈣、鎂離子，緩沖性能較差。鹽堿水體的水化學類型呈現多樣化，我國內陸型鹽堿水中，碳酸鹽型較多，氯化物型和硫酸鹽型較少，而濱海型鹽堿水氯化物較多[25]。我國內陸鹽堿水體的鹽度在1.24～13.00 g/L，堿度在3.0～44.5 mmol/L，pH在8.20～9.45[26]。鹽堿水體水質清瘦，物種多樣性低，水化學指標復雜易變，造成漁業生產中水質不易調節和控制。在水產養殖中合理使用益生菌可有效改良鹽堿水體。

2.1 pH調節作用

目前產酸的益生菌主要有乳酸菌類和芽孢桿菌(凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等)[27]。乳酸菌在無氧條件下可將葡萄糖轉化成乳酸，降低pH，進而去除亞硝酸鹽。乳酸菌降解亞硝酸鹽的效率會受到氯化鈉(NaCl)的抑制，可能是氯化鈉影響了乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生成，或抑制了乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的活性[28]。劉振民等[29]發現，在12%復原脫脂乳中，嗜溫菌在28 ℃下發酵60 h后，測得pH為4.39～4.77，嗜熱菌在37 ℃下發酵60 h后，測得pH為3.33～3.92。

酵母菌適宜的pH在3.0～7.5，其不耐受高pH，pH太高會導致其程序性死亡。Metacaspase Yca1是哺乳動物caspase蛋白酶垂直同源物，在酵母細胞凋亡中具有核心作用。在外源因素作用下，酵母菌會出現細胞膜完整但磷脂酰絲氨酸(PS)外翻、線粒體膜電位下降、細胞色素c(Cytc)釋放、活性氧物質(ROS)釋放、細胞核染色質收縮、DNA片段化等與高等生物細胞非常相似的凋亡特征。ROS也是酵母細胞凋亡中的核心調節分子。當受到外界刺激，胞內ROS產生過多而來不及清除時，機體會發生氧化應激反應，較高濃度的ROS可導致DNA、蛋白質和脂類等生物大分子功能被破壞，使細胞內線粒體膜結構受損，膜電位改變，最終引起細胞凋亡。因此，在鹽堿水體中，酵母菌需要與其他種類的益生菌相互配合使用。

芽孢桿菌產生的芽孢耐鹽堿可抵御外界不良環境，適合在鹽堿池塘水產養殖中使用。某些芽孢桿菌酵解葡萄糖可產酸。張建新等[30]發現了一株耐高溫的副地衣芽孢桿菌，該菌可以產生丙酸、丁酸和乙酸等多種短鏈脂肪酸。黑龍江八一農墾大學微生物研究室分離獲得了一株具有產酸能力的短小芽孢桿菌BY-2037，在以蔗糖為碳源、酵母膏為氮源、乙醇體積濃度為3%的培養基中，在30 ℃條件下培養時，其產酸能力最強，發酵液pH為2.93[31]。周劍等[32]發現，在葡萄糖質量濃度為100～140 g/L時，凝結芽孢桿菌RS12-6的L-乳酸發酵產率比較穩定，可以達到90～135 g/L。

2.2 鹽堿調節作用

具有鹽堿調節作用的益生菌大多是從鹽堿土、鹽堿水體(底泥)、濱海洼地等分離篩選出的耐鹽堿菌株，在非鹽堿的普通土壤中耐鹽堿細菌相對較少。嗜鹽菌的細胞膜上存在視紫紅質，能夠利用光能轉運H+形成質子驅動力，驅動ATP合酶合成ATP，通過Na+/K+轉運蛋白在胞質內積累高水平K+來抵御所處的高滲環境[33-35]；嗜堿性細菌的細胞膜上存在Na+/H+逆轉運蛋白，可將細胞內的陽離子轉運到胞外以維持胞內pH。耐鹽堿細菌還可快速攝取、積累大量氨基酸(谷氨酸、脯氨酸等)、四氫嘧啶、甘氨酸甜菜堿等相容性溶質，調節滲透壓來適應外界高滲環境[36-37]。在滲透脅迫條件下，枯草芽孢桿菌通過proJ-proA-proH途徑迅速合成游離脯氨酸以提高耐受能力[38-39]。

耐鹽堿細菌中的部分菌株具有很好的降鹽降堿調節作用。在代謝過程中，耐鹽堿細菌分解葡萄糖等有機物，產生草酸、乙酸和乳酸等多種有機酸，可以中和鹽堿水體中的CO32-、HCO3-，起到降堿作用。宋建等[40]從強堿性赤泥中分離出一株芽孢桿菌，經培養后可產生草酸、酒石酸、乙酸和乳酸，使培養基的pH從11降到6。燕紅等[41]分離獲得1株極端嗜鹽堿菌株，其在pH為13、NaCl質量濃度為200 g/L的培養基中仍可生長，以蛋白胨作氮源時，培養基pH的下降率為12.9%，氯離子(Cl-)的降解率可達46.9%。芽孢桿菌呼吸作用產生的二氧化碳與水形成碳酸，進一步電離出H+、HCO3-、CO32-，H+與OH-生成水，CO32-則被微生物誘導礦化生成碳酸鹽礦物。郭文文等[42]利用賴氨酸芽孢桿菌GW-2菌株在B4培養基上誘導形成了碳酸鹽礦物。pH對離子結合有很大的影響，pH越高越有利于碳酸鹽礦物沉淀。

嗜鹽菌的蛋白質大多數都含有非極性殘基和過量的酸性氨基酸，過量的酸性物質需要結合鈉離子以屏蔽周圍的負電荷，適應環境，依賴環境。在細菌細胞表面或其外部有各種有機大分子和其他低分子量的非聚合成分，組成胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)，EPS的主要成分是核酸、多糖和蛋白質，具有聚集細菌細胞，凝聚和吸附有機物、離子的功能[43]。EPS能夠保護細菌、藻類細胞，減輕鹽堿脅迫。Steele等[44]在培養基中添加黃明膠，使得藻細胞能夠應對鹽度脅迫。此外，EPS還參與介導CaCO3的沉淀，與大量游離的鈣離子緊密結合，并使其以CaCO3晶體的形式沉淀[45-47]。孫雪等[48]從鹽堿地篩選得到1株優勢海水鹽單胞菌菌株DB01(HalomonasaquamarineDB01)，胞外聚合物產能為0.21 g/g，降堿能力為8.7%。微生物還可通過改變EPS的產量和組成來改善其周圍環境，以減輕鹽脅迫的影響。

2.3 調節藻類

藻類作為水體環境的初級生產者，與益生菌有著密切關系，二者相互影響。菌藻共生的基礎是營養物質交換，養殖水體中的有機物可被益生菌加速分解為無機物，從而加快物質循環，促進微藻生長。藻類利用光合作用合成有機物，為異養益生菌提供營養物質[49-50]。Kim等[51]在研究菌藻相互作用時發現，根瘤菌屬(Rhizobiumsp)與小球藻(Chlorellavulgaris)共同培養，二者的生長速率分別提高了110%和11%。Amin等[52]發現，一種促生硫菌可通過分泌吲哚乙酸(IAA)來促進硅藻細胞分裂。一些菌對藻類有抑制作用，通過直接或間接的途徑最終導致藻細胞溶解，或產生毒素和釋放溶藻酶致藻細胞死亡，可用來防止藍藻等有害藻類過度生長，阻止微藻的優勢種群演替為藍藻[53-54]。Lukwambe等[55]在南美白對蝦養殖場中施用商業益生菌，在終末期階段具競爭力的藍藻(顫藻和魚腥藻)的演替受到了顯著限制。益生菌對綠藻門小球藻、硅藻門舟形藻的生長有積極影響，同時能改善水質，有利于對蝦健康。

2.4 抑制有害病菌

益生菌對致病菌具有一定的抑制作用，可以替代抗生素應用于水產養殖。益生菌能分泌表面蛋白粘附定植在水產動物腸壁上，合成大量的有機酸和細菌素等物質，降低腸道pH，競爭性地利用腸道中的營養物質，從而成為優勢菌群。酵母菌是兼性厭氧菌，能消耗腸道中的氧，抑制有害需氧菌的繁殖，起到調節腸道菌群的作用，還能為乳酸菌提供無氧環境和營養因子。竇曉明等[56]從酸奶中篩選出3株乳酸菌，其胞外產物(細菌素)能較好地抑制副溶血弧菌。楊勇[57]的試驗表明，乳酸菌胞外產物的抑菌活性依賴于酸性環境，在酸性條件下，乳酸菌對鰻弧菌的抑制效率在90%以上。益生菌在生長代謝過程中能產生多種抗菌物質，如抗菌蛋白、脂肽類抗生素等。夏京津等[58]發現，解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)HE發酵液中的活性成分——脂肽類抗生素明脂肽可以改變菌體細胞膜的通透性，使胞漿內物質外漏，對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)均為137.97 μg/L。

3 結語

我國鹽堿水域面積較廣且仍在增多，發展以漁業利用為基礎的鹽堿水體養殖已成為開發鹽堿水資源的重要方法之一[59]。但是，鹽堿水質問題限制了鹽堿水域水產養殖的發展。用益生菌改良鹽堿養殖水質作為修復鹽堿水體的一種生物方法，高效、成本低、無污染，是解決問題的重要途徑之一。鹽堿水體類型多樣，益生菌的選擇和使用還應根據水質理化指標給出針對性的方案。已有學者在耐鹽堿益生菌的篩選方面取得重要進展，耐鹽堿機制也有了系統的闡述。目前關于益生菌降鹽堿的效果已有報道，如趙媛等[60]從青海湖耐鹽堿微生物中篩選出1株降鹽率為17.30%的芽孢桿菌RM3和1株降堿率為7.60%的嗜鹽單胞菌RM25，但去除鹽堿的作用機理尚未得到明確解釋，有待于進一步深入研究。