miR-199a-5p通過靶向JunB介導心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的作用機制

鄭 茜，張 勇，楊東偉，王東偉

心力衰竭以心臟結構或功能損害導致一系列終末期臨床綜合征為特點，發病率和死亡率均較高[1]。心肌細胞凋亡為心力衰竭心肌病理損傷的重要病理生理機制，目前普遍認為抑制細胞凋亡可改善心臟病理組織變化[2]。microRNAs(miRNAs)是一組由短基因編碼、內部轉錄且天然存在的非編碼RNA，可與靶基因mRNA的3′非翻譯區(untranslated area，UTR)結合，促進mRNA降解或抑制mRNA翻譯，進而調節生理和病理過程[3]。相關研究顯示，miR-199a-5p可靶向抑制細胞增殖、遷移與侵襲并誘導凋亡[4-6]。轉錄因子活化蛋白激酶B(transcription factor activated protein kinase B，JunB)是激活蛋白-1轉錄因子家族成員，可與位于靶基因順式調控域中的認知結合序列結合，從而調節細胞周期、增殖和凋亡等多種生物學過程[7]。目前關于miR-199a-5p是否可靶向JunB調節心肌細胞凋亡的報道較少，故本研究通過結扎左冠狀動脈前降支誘導構建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，探討抑制miR-199a-5p表達和miR-199a-5p過表達時預測靶基因JunB表達及心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的變化，以期為改善心力衰竭病理損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和細胞 無特定病原體(SPF)級雄性7周齡Wistar大鼠120只，體質量(200±20)g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號SCXK(鄂)2015-0018；H9C2心肌細胞系購自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 實驗試劑和儀器 miR-199a-5p Antagomir、miR-199a-5p Agomir、Antagomir對照及Agomir對照液均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Abcam公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenylte-trazolium chloride，TTC)染色試劑盒、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-aspartate specific cysteine protease 3，Cleaved-Caspase 3)、JunB、淋巴細胞瘤-2(blymphoma 2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自北京百奧萊博科技有限公司；Olympus光學顯微鏡購自上海通灝光電科技有限公司；總RNA提取試劑盒(離心柱型)、一步法反轉錄試劑盒、Super Real熒光定量預混試劑-增強版試劑盒均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；化學發光凝膠成像系統購自美國ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、心力衰竭大鼠模型建立及給藥 恒溫(22±2)℃、恒濕(55±5)%環境下普通飼養，12 h光/暗交替適應飼養1周。將120只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、Antagomir對照組、Antagomir組、Agomir對照組及Agomir組。假手術組大鼠18只，余下大鼠均用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)誘導麻醉，打開胸腔，剪開心包暴露左冠狀動脈前降支，6-0尼龍線結扎，心肌組織染色由紅變白及心電圖出現ST段抬高改變證實冠狀動脈閉塞，假手術組穿線后不結扎，其他操作與造模步驟一致。成功誘導冠狀動脈閉塞大鼠94只，剔除4只，模型組、Antagomir對照組、Antagomir組、Agomir對照組及Agomir組隨機分為18只。持續結扎2周后分別給予Antagomir對照組、Antagomir組、Agomir對照組及Agomir組大鼠心肌內分點注射2×1010PFU/mL miR-199a-5p Antagomir對照液、Antagomir液、Agomir對照液及Agomir稀釋液各100 μL，假手術組與模型組大鼠注射等量生理鹽水。

1.2.2 樣品采集與處理 注射48 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉，脫頸致死，解剖大鼠，采集部分心臟用于TTC染色；取心肌組織，使用冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)洗去多余血跡，分別保存于4%多聚甲醛和-80 ℃低溫冰箱。

1.2.3 TTC染色測定心肌梗死面積 將新鮮心臟于-20 ℃放置10 min，進行2 mm冠狀冷凍切片，之后于37 ℃的2%TTC染液中溫浴30 min(梗死區域為白色)，4%多聚甲醛中固定24 h，采用Image J圖像分析軟件計算心肌梗死面積，心肌梗死面積=白色面積/總面積×100%。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠心肌組織病理變化 將心肌組織于4%多聚甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋制備5 μm厚度組織切片，二甲苯脫蠟至水，滴加適量蘇木素染核5 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，0.6%氨水返藍，流水沖洗后滴加適量伊紅染液染色30 s，流水沖洗，將切片脫水透明，晾干后中性樹膠封片，于400倍放大鏡下觀察并采集圖片。

1.2.5 TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡 常規石蠟包埋制備5 μm厚度石蠟切片，二甲苯中脫蠟，100%乙醇及95%乙醇水化，蛋白酶K通透，磷酸鹽緩沖液洗滌3～5次，于預冷的TUNEL工作液中反應，過氧化物酶封閉后與底物二氨基聯苯胺混合液反應顯色，光學顯微鏡下細胞質或細胞核中見有棕色顆粒，即為凋亡細胞，400倍放大鏡下隨機選擇5個視野計數凋亡細胞數，細胞凋亡指數=(TUNEL陽性細胞數/細胞總數)×100%。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)法檢測各組大鼠心肌組織中miR-199a-5p、JunB 基因相對表達水平 根據RNA提取試劑盒說明書提取各組大鼠心肌組織總RNA，測定RNA濃度；根據RNA反轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA，并以其為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，引物利用Primer Premier 5.0軟件設計，交由華大基因合成，引物序列見表1。擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環，72 ℃ 10 min充分延伸。制備RT-qPCR反應體系，以2 000 r/min離心5 min，于實時熒光定量PCR儀內進行定量檢測。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt方法計算最終目的基因的相對表達量。

表1 miR-199a-5p、JunB及內參引物序列

1.2.7 生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因分析 利用TargetScan(http://www.targetscan.org/)預測JunB可能是miR-199a-5p的潛在靶點。為驗證此結論，將野生型(wild type，WT)和突變型(mutant，MUT)JunB的3′-UTR基因片段克隆到pmirGLO雙熒光素酶miRNA報告載體，將重組報告載體與miR-199a-5p Agomir及Agomir對照共轉染至25孔板H9C2細胞中，培養48 h后，加入裂解液裂解細胞，12 000×重力加速度，4 ℃離心10 min，收集上清液，立即使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測。報告基因相對活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.8 免疫印跡法(Western Blot)檢測Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax蛋白表達情況 取心肌組織，研缽加入液氮碾碎后收集到無菌離心管內，RIPA裂解液裂解，12 000×重力加速度，4 ℃離心10 min，取上清液。測定蛋白濃度并加熱變性，十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠60 V 22 min，分離膠120 V 70 min)，轉膜(200 mA，120 min)，5%脫脂乳封閉PVDF膜2 h，一抗(1∶500)稀釋4 ℃孵育過夜；次日洗膜，換液3～6次，二抗(1∶8 000)稀釋孵育2 h，洗膜3～6次，電化學發光(ECL)法顯影，利用化學發光凝膠成像系統曝光并拍照記錄。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax與內參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 TTC染色結果顯示，假手術組大鼠心肌組織整體呈均勻玫瑰紅色，模型組、Antagomir對照組、Antagomir組、Agomir對照組及Agomir組大鼠心肌均可見不同程度的梗死灶。6組大鼠心肌梗死面積比較，差異有統計學意義(P<0.001)。進一步兩兩比較結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)；與模型組比較，Antagomir對照組及Agomir對照組大鼠心肌梗死面積比較，差異無統計學意義(P>0.05)，Antagomir組大鼠心肌梗死面積縮小(P<0.05)，Agomir組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)；與Antagomir對照組比較，Antagomir組大鼠心肌梗死面積縮小(P<0.05)；與Agomir對照組比較，Agomir組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠心肌梗死面積TTC染色圖(A為假手術組；B為模型組；C為Antagomir對照組；D為Antagomir組；E為Agomir對照組；F為Agomir組)

表2 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s)單位：%

2.2 各組大鼠心肌組織病理學變化 HE染色結果顯示，假手術組大鼠心臟組織切片細胞結構正常，有完整的細胞膜、細胞核和規則心肌紋路；模型組、Antagomir對照組及Agomir對照組大鼠心臟組織切片結構不完整，細胞排列錯亂不規則或呈波浪狀纖維，炎性白細胞浸潤；Antagomir組大鼠心肌細胞有完整的細胞膜及橢圓形細胞核，心肌細胞間排列變得有序；Agomir組大鼠有明顯心肌細胞肥大，細胞間隙增寬，心肌纖維受損嚴重。詳見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織HE染色圖(×400)(A為假手術組；B為模型組；C為Antagomir對照組；D為Antagomir組；E為Agomir對照組；F為Agomir組)

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較 TUNEL染色結果顯示，6組大鼠心肌細胞凋亡指數比較，差異有統計學意義(P<0.001)。進一步兩組間比較結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡指數升高(P<0.05)；與模型組比較，Antagomir對照組及Agomir對照組大鼠心肌細胞凋亡指數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，Antagomir組大鼠心肌細胞凋亡指數降低，Agomir組大鼠心肌細胞凋亡指數升高(P<0.05)；與Antagomir對照組比較，Antagomir組大鼠心肌細胞凋亡指數降低(P<0.05)；與Agomir對照組比較，Agomir組大鼠心肌細胞凋亡指數升高(P<0.05)。詳見表3、圖3。

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較(±s)單位：%

圖3 各組大鼠心臟組織TUNEL染色圖(×400)(A為假手術組；B為模型組；C為Antagomir對照組；D為Antagomir組；E為Agomir對照組；F為Agomir組)

2.4 各組大鼠心肌組織miR-199a-5p、JunB mRNA相對表達水平 RT-qPCR結果顯示，6組大鼠心肌組織miR-199a-5p、JunB mRNA相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。進一步兩組間比較結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠miR-199a-5p mRNA相對表達水平升高，JunB mRNA相對表達水平降低(P<0.05)；與模型組比較，Antagomir對照組及Agomir對照組大鼠心肌組織內miR-199a-5p、JunB mRNA相對表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，Antagomir組大鼠miR-199a-5p mRNA相對表達水平降低，JunB mRNA相對表達水平升高，Agomir組大鼠miR-199a-5p mRNA相對表達水平升高，JunB mRNA相對表達水平降低(P<0.05)；與Antagomir對照組比較，Antagomir組大鼠心肌組織miR-199a-5p mRNA相對表達水平降低，JunB mRNA相對表達水平升高(P<0.05)；與Agomir對照組比較，Agomir大鼠心肌組織miR-199a-5p mRNA相對表達水平升高，JunB mRNA相對表達水平降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠心肌組織內miR-199a-5p、JunB mRNA相對表達水平(±s)

2.5 miR-199a-5p與JunB靶向關系 經生物信息學分析，JunB被預測為miR-199a-5p的潛在靶基因。雙熒光素酶基因報告結果顯示，與Agomir對照組比較，miR-199a-5p Agomir組細胞中JunB-WT相對活性降低(P<0.001)。詳見圖4、表5。

圖4 TargetScan靶基因預測結果(白色部分序列為結合序列)

表5 兩組細胞JunB熒光活性相對表達量比較(±s，n=5)

2.6 各組大鼠心肌組織Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax蛋白表達比較 Western Blot結果顯示，6組大鼠心肌組織內Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax蛋白相對表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。進一步兩兩比較結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織內Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達水平升高，JunB、Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)；與模型組比較，Antagomir對照組及Agomir對照組大鼠心肌組織內Cleaved-Caspase 3、Bax、JunB、Bcl-2蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，Antagomir組大鼠Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達水平降低，JunB、Bcl-2蛋白表達水平升高，Agomir組大鼠Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達水平升高，JunB、Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)；與Antagomir對照組比較，Antagomir組大鼠心肌組織內Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達水平降低，JunB、Bcl-2蛋白表達水平升高(P<0.05)；與Agomir對照組比較，Agomir組大鼠Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達水平升高，JunB、Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。詳見表6、圖5。

表6 各組大鼠心肌組織Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax蛋白表達情況(±s)

圖5 各組大鼠心臟組織Cleaved-Caspase 3、Bax、JunB、Bcl-2蛋白表達條帶圖(A為假手術組；B為模型組；C為Antagomir對照組；D為Antagomir組；E為Agomir對照組；F為Agomir組)

3 討 論

心力衰竭是急性心肌梗死的常見并發癥[8]，miRNA是這一病理過程的重要信號標志[9]。本研究結扎心臟左冠狀動脈前降支，發現大鼠心肌組織大面積梗死，正常組織結構改變，心肌細胞凋亡，且miR-199a-5p mRNA水平升高，提示成功構建心力衰竭大鼠模型。

miR-199a-5p Antagomir為miR-199a-5p拮抗劑，與體內成熟的miR-199a-5p競爭性結合，進而抑制其作用發揮；miR-199a-5p Agomir為miRNA激動劑，可模擬內源性miR-199a-5p調節靶基因mRNA表達，miR-199a-5p過表達是導致并促進心臟病(心房顫動和心力衰竭)發展、病理生理改變的主要原因[10-12]。本研究結果顯示，與模型組比較，抑制miR-199a-5p表達可縮小心力衰竭大鼠心肌梗死面積，減輕心肌組織病理變化，減少細胞凋亡；過表達miR-199a-5p后，心力衰竭大鼠心肌組織病理損傷加重，提示miR-199a-5p對心力衰竭大鼠心肌損傷的誘導作用。

激活蛋白-1是炎癥和細胞凋亡的關鍵調節因子，其亞基JunB可作為針對細胞因子和內質網應激介導的細胞凋亡防御機制的調節劑，過表達時可保護細胞免于凋亡[13]。另有研究顯示，miR-199a-5p可誘導細胞凋亡，過表達時可抑制人類胚胎腎293T細胞中JunB表達[14]。本研究熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-199a-5p可降低JunB 3′WT-UTR的活性，對靶點JunB 3′MUT-UTR活性幾乎無影響，提示JunB為miR-199a-5p靶基因；同時結果顯示，與模型組比較，抑制miR-199a-5p表達時，miR-199a-5p mRNA降低，JunB mRNA表達水平升高，miR-199a-5p過表達時，miR-199a-5p mRNA升高，JunB mRNA表達水平降低，提示miR-199a-5p可直接靶向JunB基因的3′UTR抑制其轉錄活性，抑制miR-199a-5p表達時，JunB蛋白表達水平升高，而miR-199a-5p過表達時，JunB蛋白表達水平降低，證實miR-199a-5p可靶向介導JunB表達。參與細胞凋亡的外在和內在途徑的蛋白包括Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Bax)[15-16]，其中，Caspase 3是需要半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員，其激活可作為細胞凋亡發生的指標[17]。Bcl-2認為是細胞凋亡蛋白家族重要的調控蛋白，可抑制凋亡因子釋放，Bax因其BH3結構域而促進凋亡[18]。本研究結果顯示，與模型組比較，抑制miR-199a-5p表達時，凋亡指示因子Cleaved-Caspase 3及Bax蛋白表達水平降低，JunB和抗凋亡因子Bcl-2升高，miR-199a-5p過表達時，相關蛋白表達情況相反，提示miR-199a-5p過表達可靶向抑制JunB表達，誘導心肌細胞凋亡。

綜上所述，miR-199a-5p可誘導心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡，可能與靶向抑制JunB表達有關。