殼寡糖對過氧化氫誘導肝細胞損傷的改善作用及機制

劉 朋，侯智興，茅洪維，李 恒,*，龔勁松，蔣 敏，許泓瑜，許正宏，史勁松,*

（1.糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江南大學生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫 214122；2.上海市農業科學院食用菌研究所，上海 201403；3.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122；4.糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122）

氧化應激與多種疾病的發生發展相關，其引起的過量氧自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以導致DNA和細胞大分子大規模損傷，如改變膜的流動性和通透性、破壞細胞骨架、促進蛋白變性等，最終引起細胞凋亡、癌變等在內的細胞功能障礙現象[1-2]。因此，抗氧化應激治療成為改善疾病進程的有效策略之一。殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）作為自然界中的一種低聚寡糖，具有抗腫瘤、抗凝、傷口修復、抗氧化等生理活性。此外，COS在酒精性肝損傷、脂肪肝、肝癌等多種肝臟疾病中均表現出較好的改善效果，但其具體作用機制仍然不清楚[3-5]。鑒于氧化應激在肝臟疾病中的重要作用[6-7]，本實驗利用過氧化氫（H2O2）誘導肝細胞L-02建立氧化應激細胞損傷模型，分析COS對其保護作用，為COS的保肝作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

COS（聚合度2～4） 揚州日興生物科技股份有限公司；胎牛血清 以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、活性氧熒光探針（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）上海碧云天生物試劑公司；逆轉錄試劑盒 上海翊圣生物科技有限公司；RPMI 1640培養基、H2O2美國Sigma-Aldrich公司；SYBR Green Mix試劑盒 瑞士Hoffmann-La Roche公司；細胞毒性實驗細胞計數（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒 日本同仁公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan MK3全波長酶標儀 德國Eppendorf公司；CFX96 Touch熒光定量聚合酶鏈反應分析儀美國Bio-Rad公司；CytoFlex流式細胞儀 美國Beckman公司；實時單細胞多模態分析儀 江蘇瑞明生物科技有限公司；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

L-02細胞生長在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中，于37 ℃、5% CO2的環境中培養。

1.3.2 L-02細胞存活率檢測

待細胞生長至對數期后，用胰蛋白酶消化以獲得細胞懸液，96 孔板中每孔加入相同體積的L-02細胞懸液（1.2×104個），靜置培養24 h。棄上清液，并加入添加或不添加COS（終質量濃度31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg/mL）的新鮮培養基繼續培養24 h。然后吸棄每孔培養基，用pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebuffered saline，PBS）沖洗3 遍，更換含10% CCK-8溶液的無血清培養基，避光孵育1.5～2.0 h后于450 nm波長處檢測OD值，根據下式計算細胞存活率。

1.3.3 H2O2刺激L-02細胞氧化應激模型的建立

96 孔板每孔加入同體積L-02細胞懸液（1.2×104個），待細胞貼壁后，添加不同濃度H2O2（0.5、1、2、4、8 mmol/L）繼續培養1 h。然后通過CCK-8檢測不同分組細胞在450 nm波長下的吸光度，細胞存活率計算同1.3.2節，通過計算細胞存活率以確定H2O2造模濃度。

同體積的L-02細胞懸液加入96 孔板中（1.2×104個）。細胞分為對照組、模型組（H2O2組）、低劑量組（質量濃度100 μg/mL COS）、中劑量組（質量濃度200 μg/mL COS）和高劑量組（質量濃度400 μg/mL COS）。待細胞完全貼壁后，根據分組不添加或添加不同質量濃度的COS至培養基中繼續培養24 h，在最后1 h時加入H2O2（終質量濃度為1 mmol/L、母液濃度為880 mmol/L）。后續細胞存活率檢測同1.3.2節，ROS水平分析方法見1.3.4節。

1.3.4 ROS水平測定

激光共聚焦顯微鏡分析：細胞處理參照1.3.3節。細胞在H2O2處理后，去掉培養基并用PBS清洗3 遍后，加入10 mmol/L DCFH-DA探針（終濃度為10 μmol/L），避光37 ℃孵育30 min后，無血清培養基清洗3 遍。然后加入Hoechst 33342探針孵育15 min進行細胞核復染。最后，在發射波長（λex）/激發波長（λem）＝488 nm/525 nm和λex/λem＝346 nm/460 nm條件下經激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。

流式細胞儀分析：步驟同上，在獲得細胞懸液（1×106個/100 μL）后加入1 μL DCFH-DA探針避光37 ℃孵育30 min后，850 r/min離心3 min，PBS清洗掉未進入細胞的游離探針。最后重懸于PBS中，選擇熒光素5-異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）通道進行流式細胞儀分析。

單細胞納米生化分析：步驟同上，分析質量濃度400 μg/mL COS對損傷單細胞的保護作用。細胞經H2O2處理后，倒掉培養基并用PBS清洗3 遍后，更換0.5 mL新鮮無血清培養基。參照Zheng Xinting等[8-9]方法，在正常1640培養基中孵育，記錄穩態背景熒光（F0），之后將光纖納米探針精確插入單個細胞的細胞質中，隨即在培養基中添加0.5 mL質量濃度20 μmol/L DCFH-DA探針溶液，通過熒光檢測系統在單個細胞中測定熒光強度（F1）以動態觀察胞內ROS水平變化情況。

1.3.5 線粒體膜電位變化測定

細胞處理參照1.3.3節。在獲得細胞懸液（1×106個/100 μL）后加入質量濃度5 μg/mL羅丹明123探針避光37 ℃孵育30 min后，850 r/min離心3 min，PBS清洗去掉未入胞的游離探針。最后重懸于PBS中，選擇FITC通道進行流式細胞儀分析。

1.3.6 熒光定量聚合酶鏈式反應分析

分離總RNA后，根據Hifair?III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將0.5 μg RNA逆轉成目標cDNA。反應體系為200 ng cDNA，各5 nmol/L的上下游引物，SYBR Green混合物，總體系體積為10 μL，在95 ℃15 s、60 ℃ 30 s條件下反應，共40 個循環。測定核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 p45-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）、半胱氨酸蛋白酶 9（Caspase9）、β細胞淋巴瘤-2（β-cellymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關蛋白X（Bcl-2-associated X protein，Bax）和β-肌動蛋白（β-actin）基因的相對表達水平，并用2-ΔΔCT方法進行分析。引物序列見表1。

表1 熒光定量聚合酶鏈式反應引物序列Table 1 Primer sequences used for florescence quantitative polymerase chain reaction

1.4 數據統計與分析

實驗結果以平均值±標準差表示，數據采用單因素方差分析，P＜0.05具有顯著性差異。所有數據結果用GraphPad Prism 5軟件分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 COS對L-02細胞存活率的影響

COS處理24 h后，與對照組比較，COS在質量濃度31.25～1 000 μg/mL范圍內對L-02細胞增殖能力無顯著影響（P＞0.05）（圖1）。

圖1 COS對L-02細胞存活率的影響Fig.1 Effect of COS on L-02 cell viability

2.2 H2O2對L-02細胞氧化應激模型的影響

由圖2可知，隨H2O2濃度的增加，L-02細胞增殖活力逐漸降低，與對照組比較，當1 mmol/L H2O2刺激細胞1 h時細胞存活率顯著下降（P＜0.05），而且細胞形態表現出明顯的皺縮、變圓及觸角斷裂等變化。綜合考慮，選擇1 mmol/L H2O2誘導L-02細胞1 h進行后續實驗。

圖2 H2O2對L-02細胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of H2O2 on proliferation of L-02 cells

2.3 COS對損傷L-02細胞增殖活力的改善作用

如圖3所示，相較于對照組，H2O2組細胞增殖活力顯著降低（P＜0.05）。與H2O2組相比，低劑量組（質量濃度100 μg/mL COS）對細胞增殖活力無顯著改善作用（P＞0.05），而中劑量和高劑量COS可以顯著提高H2O2損傷L-02細胞的增殖活力（P＜0.05）。進一步觀察細胞形態變化發現，COS明顯改善了氧化應激導致的細胞皺縮、變圓等狀態。

圖3 COS對H2O2損傷L-02細胞的改善作用Fig.3 Ameliorative effect of COS on proliferation and morphology of H2O2-injured L-02 cells

2.4 COS對損傷L-02細胞ROS水平的改善作用

DCFH-DA是檢測ROS的最常用探針，本身無熒光，滲透進胞內后熒光強度與ROS水平成正比。經DCFH-DA探針檢測后發現，與對照組比較，H2O2組的熒光強度明顯增強，經COS處理后的細胞熒光強度則呈下降趨勢（圖4A）。通過流式細胞儀定量分析發現，H2O2組平均熒光強度高度顯著高于對照組（P＜0.001），與H2O2組比較，COS中高劑量組平均熒光強度顯著降低（P＜0.05）（圖4B）。另外，通過單細胞納米生化分析儀檢測發現，加入DCFH-DA探針后，與對照組比較，H2O2組細胞的熒光強度逐漸增強，高劑量COS干預組細胞的熒光強度則明顯低于H2O2組，結果表明，COS處理后可以緩解胞內ROS水平升高（圖5）。

圖4 COS對H2O2損傷L-02細胞ROS水平的改善作用Fig.4 Effect of COS on ROS level in H2O2-injured L-02 cells

圖5 L-02單細胞中ROS水平變化Fig.5 Changes in ROS level in single L-02 cells

2.5 COS對損傷L-02細胞線粒體膜電位變化的影響

線粒體膜電位的下降象征了細胞凋亡現象的發生。如圖6所示，相較于對照組，H2O2組中線粒體膜電位下降的細胞占比高度顯著提高（P＜0.001）。與H2O2組相比，質量濃度200 μg/mL和400 μg/mL COS處理則極顯著或高度顯著降低了該部分細胞的占比（P＜0.01、P＜0.001）。以上結果說明COS的處理能夠明顯改善由H2O2造成的L-02細胞凋亡。

圖6 COS對H2O2損傷L-02細胞線粒體膜電位變化的影響Fig.6 Effect of COS on mitochondrial membrane potential of H2O2-injured L-02 cells

2.6 COS對H2O2損傷L-02細胞炎癥和凋亡相關基因mRNA相對表達量的影響

鑒于氧化應激損傷與細胞凋亡之間具有直接關系，為進一步評估COS對損傷細胞的修復作用，本實驗探究了損傷細胞炎癥、凋亡相關基因的mRNA相對表達量。如圖7所示，與對照組比較，H2O2組細胞炎癥因子相關基因IL-6、TNF-α和凋亡相關基因Caspase 3、Caspase 9、BaxmRNA相對表達量極顯著或高度顯著提高（P＜0.01、P＜0.001）；與H2O2組相比，COS處理后細胞炎癥因子相關基因和凋亡相關基因存在下降趨勢，而與對照組比較，Bcl-2mRNA相對表達量在H2O2組細胞中高度顯著下降（P＜0.001）。經COS處理后，Bcl-2mRNA相對表達量較H2O2組顯著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。

圖7 COS對H2O2損傷L-02細胞炎癥和凋亡相關基因水平的影響Fig.7 Effect of COS on mRNA expression levels of inflammation- and apoptosis-related genes in L-02 cells injured by H2O2

2.7 COS對H2O2損傷L-02細胞Nrf2/HO-1通路的調控作用

轉錄調節因子Nrf2與其下游調控因子HO-1二者通過級聯反應在氧化應激反應中發揮關鍵作用。為探究COS的潛在作用機制，分析了Nrf2和HO-1mRNA相對表達量。如圖8所示，與對照組比較，H2O2組細胞Nrf2、HO-1mRNA相對表達量高度顯著或極顯著提高（P＜0.001、P＜0.01）；與H2O2組相比，中、高劑量COS孵育后Nrf2、HO-1mRNA相對表達量顯著或極顯著下降（P＜0.05、P＜0.01）。這說明Nrf2/HO-1通路可能參與了COS抗L-02細胞損傷的作用過程中。

圖8 COS對H2O2損傷L-02細胞Nrf2/HO-1通路的影響Fig.8 Effect of COS on Nrf2/HO-1 signaling pathway in H2O2-injured L-02 cells

3 討 論

氧化應激反應在腫瘤、炎癥以及神經性疾病中均發揮重要作用，而肝臟作為機體主要的解毒器官，在物質代謝和解毒過程中極易受到氧化應激的損傷，從而引起肝臟的炎癥、水腫甚至壞死現象發生[10-12]。機體內過量ROS的出現是氧化應激的主要表現形式，主要由肝臟中的線粒體產生，并由抗氧化酶、II相代謝酶等清除ROS，從而維持氧化還原系統的穩態[13-14]。然而有害刺激可以打破氧化應激的平衡狀態，氧化應激刺激能夠通過線粒體、死亡受體、內質網應激等途徑直接介導細胞凋亡及病理損傷[15]。因此，以高水平ROS為特征的氧化應激與肝病的發生發展關系越來越密切，尋找具有高抗氧化能力的ROS清除劑顯得十分有必要。

COS作為天然抗氧化劑，被廣泛應用于功能性食品的開發利用，已有報道顯示COS擁有抗炎、降血脂、降血糖、心腦血管疾病保護等獨特的生理活性[5-7,16-18]。H2O2通過誘導ROS的過量產生導致蛋白質變性或脂質損傷，是誘導氧化應激模型最常用的促氧化劑[19]。本實驗通過H2O2誘導肝細胞L-02氧化應激反應，用來探究COS對肝細胞氧化應激的改善效果。結果發現，COS可以降低H2O2誘導L-02細胞氧化應激的ROS水平，改善細胞增殖活力及細胞病理狀態。監測單個細胞內ROS動態變化有助于了解COS對其作用機制，結果發現在給予H2O2刺激后，與對照組相比，未經COS處理的L-02細胞內ROS水平高度顯著升高（P＜0.001），然而，COS處理組的胞內ROS水平則一定程度上低于H2O2組。

鑒于氧化應激與細胞凋亡具有直接誘導關系，因此，評估COS對損傷L-02細胞凋亡的保護作用十分有意義。細胞生理功能的正常發揮依賴于線粒體內膜兩側形成的梯度電位，因此，線粒體膜電位的下降是細胞早期凋亡的一種表現形式[20]。當細胞受到氧化應激刺激時，會誘導線粒體膜電位降低或喪失，能量耗盡，而導致細胞凋亡[21-23]。在H2O2誘導的L-02細胞氧化應激模型中，線粒體膜電位明顯下降，COS可以顯著改善損傷細胞的線粒體膜電位下降情況。Caspase 3作為Caspase家族成員之一，是參與細胞凋亡過程的關鍵蛋白酶，扮演著細胞凋亡實施者的角色[24]。Bcl-2和Bax是目前已知的Caspase 3上游調控基因，Bax在外界刺激因素下可以聚集到線粒體膜上，并通過形成多聚體形式破壞線粒體膜，從而影響膜內離子濃度，促進促凋亡因子的釋放[25-26]。促凋亡因子會激活Caspase 9，而活化的Caspase 9進一步誘導Caspase 3活化。但是Bcl-2的高表達可以抑制促凋亡因子的釋放，平衡氧化應激反應，阻斷凋亡進程[27]。本研究中COS可以抑制H2O2誘導的L-02細胞氧化應激模型中Caspase 3、Caspase 9、Bax基因水平的高表達，提高Bcl-2基因水平，進一步體現出COS對損傷細胞的抗凋亡效果。有研究發現，COS在神經元損傷和腸道氧化應激損傷中均可以通過降低Caspase家族的表達水平從而發揮保護作用[28-29]。這與本實驗結果基本一致。Nrf2作為細胞氧化應激的關鍵蛋白，介導著胞內凋亡、炎癥等多種生理反應，可增強下游抗氧化酶的表達，在機體抗氧化應激過程中起重要作用。然而，本研究結果顯示，與對照組比較，H2O2刺激提高細胞中Nrf2基因的表達水平，且COS可逆轉其水平。陳晶晶等研究發現，H2O2亦可誘導SH-EP1細胞中Nrf2的高表達[30]。在生理狀態下，Nrf2以非活性形式存在于細胞質內，在機體處于應激狀態時，會進入細胞核發揮其級聯效應。故在后續實驗中，應進一步檢測細胞核內Nrf2及其下游因子的蛋白水平變化情況，以剖析COS改善L-02細胞氧化應激損傷的作用機制。

綜上，COS可改善H2O2誘導L-02細胞的凋亡和氧化應激損傷，研究結果可為COS的進一步功能評價和應用提供一定的參考。