新型電化學發光儀甲狀腺激素項目性能驗證

汪津 唐妮娜

為滿足醫院快速發展的需求，泰州市中醫院檢驗科更新了一臺速度達到300測試/h的全自動電化學發光免疫分析儀：羅氏cobas 8000 e 801，用于檢測甲狀腺激素指標。相較于原先的羅氏cobas 6000 e 602，除了檢測速度的提升，e 801允許運行狀態下加載試劑和消耗品，具有較高的正常運行時間[1]。根據中國合格評定國家認可委員會制定的ISO 15189《醫學實驗室質量和能力認可準則》[2]的規定，現用檢驗程序的要素包括儀器、試劑、校準品等如果發生變更，如試劑升級、校準品溯源性改變、儀器更新等，都需要重新對其性能進行驗證[2]，以保證檢驗質量，為臨床提供精確的數據。本研究對羅氏cobas 8000 e 801電化學發光免疫分析儀分析甲狀腺功能五項激素基本性能進行驗證，其中包括：精密度、正確度、線性范圍、參考區間、分析靈敏度等性能。

1 材料與方法

1.1 材料

來源于泰州市中醫院2022年8—10月門診，住院，體檢中心標本，排除脂血、溶血、黃疸血清樣品。

1.1.1 儀器與試劑

德國羅氏診斷有限公司cobas 8000 e 801全自動電化學發光免疫分析儀、e 801配套試劑與校準品批號，見表1。

表1 羅氏cobas 8000 e 801試劑及校準品批號

1.1.2 質控品

英國朗道免疫質控品，水平1批號2074EC，水平2批號2079EC。

1.1.3 實驗室能力對比驗證樣本（proficiency testing，PT）

2022年國家衛生健康委臨檢中心內分泌室間質量評價樣本 202211，202212，202213，202214，202215。

1.2 方法

按照ISO15189《醫學實驗室質量和能力認可準則》的規定并參照相關文件[3]，檢驗的具體操作按照泰州市中醫院檢驗科儀器及項目操作規程，對各項目進行校準通過，每日質控在控前提下進行性能驗證。

1.2.1 驗證精密度

精密度驗證應包括重復性和實驗室內精密度。參照相關文件[4-5]進行操作，用于驗證的樣本濃度水平接近廠家精密度聲明試驗中所使用的濃度水平，連續測定5 d，每天一個分析批，每批測定兩個濃度水平，其中每個濃度水平同一樣品進行3次的重復測定。通過相關文件[6]與Excel 2016，計算數據得出批內標準差和實驗室內標準差與廠方的聲明值進行比較，若＜廠家聲明值，則驗證通過，若＞廠家聲明值，需進一步計算廠家聲明的驗證值。計算公式見圖1。

圖1 廠家聲明驗證值計算公式

1.2.2 正確度驗證

參照相關文件[3]中可比性驗證方法，與國家衛生健康委臨檢中心PT項目結果比對，使用室間質評樣本的靶值進行評價，檢測值與靶值之間的偏倚（%）與1/2的允許總誤差（allow total error，TEa）進行比較，偏倚（%）=（測定值-靶值）÷靶值×100%；同時與泰州市中醫院檢驗科經中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS） 認可的經性能驗證符合要求的羅氏cobas 8000 e 602檢測系統進行比對，20份樣本的被測物濃度在線性范圍內均勻分布，覆蓋醫學決定水平。

1.2.3 線性范圍驗證

參照相關文件[7-9]提供的方案進行驗證。選取高濃度樣品與低濃度樣品的值接近廠商聲明線性范圍的上限和下限。將低濃度樣品（L）與高濃度樣品（H）以5 L、4 L+1 H、3 L+2 H、2 L+3 H、1 L+4 H、5 H的體積比例混合，得到6個等濃度間隔的不同水平樣品系列。將樣品系列分別按照低→高、高→低、低→高的順序各檢測一次，3次得到計18個結果。將檢測結果進行多項回歸分析，得出最優擬合方程。同時要求測量數據具有較高的測量精密度，否則將會降低統計功效。其次，只有結合臨床的實際情況才能夠具有實際價值，多項式回歸分析強調利用統計學方法判斷線性，不會考慮臨床過程中允許存在一定誤差，為此提出了對統計學標準的非線性作程度判斷，計算最優擬合曲線與直線的平均差異值（average difference line，ADL），設定 PctBnd ＜ 5%為臨床可允許的誤差，將ADL與WS/T 492-2016《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》的臨界值比較，ADL小于臨界值，判定為臨床可接受的非線性，最適方程為線性方程不需判斷。

1.2.4 參考區間驗證

參照相關文件[6]收集20名健康人血清標本，要求其年齡，性別等均勻分布，對羅氏試劑說明書提供的參考區間進行驗證，20個樣本超出參考區間的數據不超過2個，則驗證通過。

1.2.5 功能靈敏度驗證

選取濃度接近廠家聲明的最低檢測限的樣本，連續測定5 d，每天該樣本重復測定3次，計算日間重復變異系數（coefficient of variation，CV），CV=標準差 /均值×100%＜20%[10]，則驗證通過。

1.3 統計學方法

采用Excel 2003和SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計算相關系數和回歸方程。

2 結果

2.1 驗證精密度結果

每個項目的兩個濃度的重復性標準差（standard deviation，SD）和實驗室內標準差（SD）均小于廠家聲明值或者驗證值，具體結果見表2，驗證通過。

表2 項目精密度驗證結果

2.2 正確度驗證結果

2.2.1 PT結果可比性驗證

用留存的2022年國家衛生健康委臨檢中心第一次發放的PT樣本在e 801儀器上的檢測結果與回報結果的靶值偏倚分析見表3，均在允許范圍內（T3/TSH/FT3/FT4：靶值 ±25%；T：靶值±20%）。驗證通過。

表3 國家衛生健康委臨檢中心PT樣本在e 801 檢測結果

2.2.2 不同檢測系統可比性驗證

20份濃度覆蓋醫學決定水平，均勻分布在線性范圍的樣本在e 801檢測系統上的檢測結果與泰州市中醫院檢驗科CNAS 認可的經性能驗證符合要求的羅氏cobas 6000 e 602檢測系統進行比對，相關系數R2均＞0.99 ，系統差異性小，因此改變檢測系統后，對臨床結果影響小。具體比對結果見表4。

表4 e 602與e 801項目可比性驗證

2.3 線性范圍驗證結果

各項目的最優擬合方程，數據的精密度檢驗及非線性程度的判斷見表5，驗證通過。同時驗證線性上限超出廠家所給上限的80%，驗證線性下限未超出廠家所給的下限，因此廠家給出的線性范圍可用于臨床。

表5 線性范圍驗證數據

2.4 參考區間驗證結果

選取的20名體檢中心的健康人樣本結果均在廠家給出的參考范圍以內，驗證通過。結果見表6。

表6 參考區間驗證結果

2.5 功能靈敏度驗證結果

選取濃度接近廠家聲明的最低檢測限的樣本，連續測定5 d，每天該樣本重復測定3次，計算得日間CV為8.04%＜20%，驗證通過。數據見表7。

表7 功能靈敏度驗證數據

3 討論

查閱各種文獻，發現羅氏幾代電化學發光免疫分析儀的性能驗證多有研究報道，包括型號e 411，e 601，e602等。對于2019年上市的羅氏新一代電化學發光免疫分析儀e 801的性能驗證鮮有對甲狀腺功能項目研究，性能驗證具有重要的意義，對于實驗中涉及中的各項檢驗項目、實驗所涉及的各種檢測系統的性能以及進行實驗所涉及的方法，都需要與臨床要求相符，符合檢驗所需，以便保證患者的標本檢測足夠準確可靠，同時檢驗人員應對儀器的性能充分掌握。泰州市中醫院檢驗科對新引進的羅氏 e 801上檢測甲狀腺功能五項激素進行性能驗證，包括精密度、正確度、線性范圍、參考區間，以及TSH的分析靈敏度。

精密度是指在同一檢測系統下，對同一樣本進行重復多次檢測，所得結果一致性程度，可以用標準差或變異系數來表示不精密度，值越小，代表精密度越好，是反映測定結果隨機誤差大小程度的指標。在檢測系統中，精密度性能屬于其中較為基本的一個分析性能，也是完成其他方法學評價的基本項。本次精密度檢測的方案所采用的樣本為是2個濃度水平，每日需進行3次檢測，需保持5 d內連續檢測，計算重復性精密度和實驗室內精密度。選用的是廠家精密度評價時濃度一致的臨床血清樣本，不應用質控品進行重復性試驗，因為質控品與天然患者樣品的檢測存在基質差異。計算所得的重復性精密度和實驗室內精密度均小于廠家聲明值或驗證值，驗證通過。

為了更好地反映正確度的驗證情況，本次驗證使用了兩種方法，與國家衛生健康委臨檢中心發放的PT樣本進行偏倚分析，另外一種方法是與本科室已通過ISO15189 評審的儀器進行可比性驗證。PT樣本在e 801上的檢測都為可接受結果，偏倚均＜1/2允許總誤差，大部分偏倚＜1/3允許總誤差，考慮到該PT樣本為重復凍融的樣本，而且凍存時間超過一個月。進行可比性驗證的標本覆蓋項目的廠家聲明的線性范圍，并且涵蓋醫學決定水平，相關系數R2均＞0.99 ，系統差異性小 ，因此改變檢測系統后對臨床結果影響小。

分析測量范圍便是所謂的定量檢測項目的線性范圍，在整個檢測系統中，如儀器、試劑、校準品、質控品、操作程序、檢驗人員等，可以對系列分析濃度的儀器最終輸出的信號間是否呈恒定比例的性能進行評估的指標。針對新鮮患者標本，配比比例高低值不同，便可以通過測定，驗證實測值和理論值的線性關系，從而對每個檢測項目的線性范圍進行評估。隨著檢驗學的不斷發展及進步，對于測量范圍的評價分子方法也越來越多，初期均是通過目測分析進行判斷，逐漸地發展開始出現了統計學回歸分析，由美國臨床和實驗室標準協會制訂的評價方案 EP6P，再發展到目前的EP6A指南，有了較大改進。其中EP6A方法是通過統計理論來對數據進行有效分析，并在臨床上允許存在一定范圍內的誤差，從而對非線性進行合理判定，實際運用價值顯著[11]。選用的患者血清樣本高低值濃度盡可能接近廠家聲明的線性范圍上限和下限，本次驗證T3、T4、TSH等項目在廠家聲明的線性范圍內均具有良好的線性。T4和FT4之間滿足結合常數K公式的動態平衡，稀釋液與標本在蛋白種類和水平前具有一定的水平差異，同時其他所結合的常數K也有一定的區別。所以FT4不適合進行線性稀釋[12]。 FT3多是由T4所轉變的，且占據的比例較高，二者之間具有一定程度的動態平衡性。FT3與FT4所具有的效應相同，如果溯源FT3與FT4，可通過使用平衡透析或超濾法處理，這目前被定義為檢測游離激素的“金標準”[13]。

參考區間的設定可將正常人群作為檢測項目，隨著人群的年齡、性別等樣本類型的變化，設立相應的區間。參考區間最常采用的建立方法是95%分布區間，因此根據檢測項目選擇不同年齡、不同性別要求樣本，共選擇健康人群20例作為樣本，所得到的測定結果，至少需要18個或以上處于廠家所聲明的參考區間內，說明參考區間驗證通過，廠家所聲明的參考區間可用于本實驗。其實，現在提倡個體化醫療和精準醫療，所以“建立個體參考值”越來越受重視。

本次驗證還進行了TSH項目的分析靈敏度，TSH項目檢測是甲狀腺功能檢測的重要指標之一、在人血清中含量極低，因此對檢測儀器的靈敏度，尤其是對低值區信號區分度的要求極高；若檢測體系中的本底值過高的話，就會對低值區的檢測造成較大干擾產生誤差，所以TSH靈敏度常被用來作為評估檢測儀器靈敏度的一個標準。驗證方法選用選取濃度接近廠家聲明的最低檢測限的樣本，連續測定5 d，每天該樣本重復測定3次，計算得日間CV為8.04%，＜20%，驗證通過。

綜上所述，本科室完成了對羅氏e 801 電化學發光免疫分析儀上檢測的T3、T4、TSH、FT3、FT4項目的性能驗證。其中包涵精密度、正確度、線性范圍、參考區間，以及TSH的分析靈敏度，驗證均通過。說明新引進的儀器可以用于甲狀腺五項激素的臨床檢測，質量達標。