獻血者HCV篩查及確認試驗結果分析

許雷 馬維娟 張志杰 張龍穆

2015年全球7 100萬人有慢性HCV感染，我國一般人群抗-HCV陽性率約為0.60%[1]，自從1998年實現無償獻血和HCV篩查以來，獻血人群HCV感染率大幅下降。現用于血液篩查HCV感染的指標包括血清學和HCV RNA檢測，HCV RNA檢測是丙型肝炎早期診斷最有效指標，但在丙型肝炎感染者中HCV RNA可以由陽性轉陰性或波動性出現，病毒載量極低的情況下（血液HCV RNA檢測陰性）仍有造成輸血傳播的風險[2]。目前國內采供血機構多數通過檢測血清抗-HCV結合核酸檢測來判斷是否有HCV的感染[3-5]。用于血液篩查的抗-HCV試劑主要有：酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）間接法和雙抗原夾心法，有研究指出，不同廠家抗-HCV試劑的靈敏度和特異性有明顯差異[6]。《血站技術操作規程》（2019版）規定可采用一遍血清學一遍核酸進行血液HCV篩查，評價選擇符合采供血機構需求的血清學檢測試劑，可以更好地發揮酶免檢測與核酸檢測的互補效果，更好地為臨床提供安全合格血液。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年1—12月青島地區獻血者標本119 602人例進行抗-HCV檢測，留取部分抗-HCV反應性標本（61例）進行補充實驗，其中單試劑反應性46例，雙試劑反應性15例。采用EDTA- K2分離膠抗凝真空采血管（美國BD公司），采血管在采血后4 h內離心，1 100 r/min離心15 min后保存于2～8℃冰箱，核酸檢測完標本置于-30℃冰箱凍存，以備進行補充和確認試驗。

1.2 方法

1.2.1 血清學檢測方法

使用哈美頓全自動加樣儀STAR（瑞士Hamilton公司）、哈美頓全自動酶免分析儀 FAME （瑞士Hamilton公司）進行血清學檢測。抗- HCV ELISA 間接法試劑包括：Murex HCV ELISA（美國，以下簡稱a試劑）；新創抗-HCV檢測試劑（廈門，以下簡稱 b試劑）；Ortho HCV 3.0 ELISA（美國，以下簡稱c試劑）；麗珠抗-HCV檢測試劑（珠海，以下簡稱 d試劑）。ELISA夾心法試劑：萬泰第4代ELISA 檢測試劑（北京，以下簡稱夾心法試劑）。血清學確證試劑使用萬泰HCV確證試劑（北京，簡稱RIBA）。

1.2.2 核酸檢測方法

使用Procleix Panther核酸檢測系統（西班牙蓋立復）及其檢測試劑Procleix Elite；羅氏Cobas s 201核酸檢測系統（美國羅氏）及Cobas MPX 2.0檢測試劑進行核酸檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 ELISA檢測

STAR全自動加樣儀加樣，采用全自動酶免分析標儀FAME進行兩種試劑兩次檢測，按儀器和試劑盒的要求進行操作。應用夾心法試劑對61例標本進行再次檢測，按試劑使用說明書，450/630 nm 波長下比色讀取吸光度值（optical density，OD），樣本S/Co值≥1判斷為反應性，樣本S/Co＜1判定為非反應性。

1.3.2 NAT檢測

Panther檢測系統采用單人份檢測模式，S/Co值≥1 判斷為反應性，樣本S/CO值＜1判定為非反應性，初次檢測有反應性的標本進行項目鑒別實驗。Cobas s 201檢測系統采用6人例混樣檢測模式，經初次檢測無反應性的標本判為陰性，初次檢測有反應性進行拆分實驗，循環數閾值（cycle threshold，Ct值）＜60為陽性，Ct值無顯示為陰性。

1.3.3 補充確認試驗

對61例標本進行RIBA法和RNA檢測，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。其中RIBA確認試劑按照使用說明書至少2條帶≥1+為陽性，1條帶≥1+為可疑，沒有≥1+條帶為陰性，確認試劑中出現一次陽性判為確認陽性。確認試驗RIBA陽性（RIBA+）和（或）HCV RNA陽性（RNA+）的樣本判定HCV真陽性，RIBA試劑均不確定且HCV RNA陰性（RIBA IND /RNA-）的判為不確定，RIBA和HCV RNA陰性判定為真陰性樣本。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，不同試劑之間抗-HCV陽性率以n（%）表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗-HCV初篩（間接法）反應性

表1顯示，抗-HCV間接法試劑初篩檢測獻血者標本119 602人例，反應性210例（1.76‰），其中單試劑反應性187例（1.56‰），占比89.05%（187/210）。進口間接法試劑反應性比例高于國產試劑（a試劑 VS b試劑、c試劑 VS d試劑），差異均有統計學意義（χ2=20.525、39.321，P＜0.05）。

2.2 2種試劑與確證結果的符合性

本研究留取的61例初篩反應性標本中，確認試驗陽性標本14例（RIBA+/RNA+ 9例 、RIBA+/RNA- 5例），確認陰性標本40例（RIBA-/RNA-）（另外7例為RIBA IND/RNA-，按不符合統計，表2）。

表2 2種試劑檢測結果與RIBA確證結果的符合情況（例）

2.3 2種試劑與確證試驗（RIBA及HCV RNA）結果對比

表3顯示，本研究留取的36例間接法（c試劑）反應性標本，夾心法試劑檢測反應性16例，其中HCV RNA或RIBA確證陽性14例，1例為RIBA確證不確定，1例陰性。其余20例初篩單試劑反應性標本，夾心法試劑檢測為非反應性，RIBA確證結果15例為陰性，5例為不確定。

表3 兩種試劑檢測結果不一致標本的確認試驗結果（例）

3 討論

HCV主要通過輸血及血液制品傳播，也可經破損的皮膚和黏膜傳播，HCV病毒顆粒結構區包括：核心蛋白基因區（C區）和衣殼蛋白基因區（E1，E2）；非結構區包括：NS2、NS3、NS4、NS5。HCV血液篩查試劑大體上分為三類：血清學檢測HCV抗體的ELISA試劑（間接法/夾心法）、血清學檢測HCV抗原的ELISA試劑、利用 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）或核酸擴增-轉錄介導的擴增技術（transcription mediated amplification，TMA）等方法檢測HCV RNA的核酸檢測試劑等。雖然近年來HCV抗體的檢測敏感性得到很大的提高，但仍存在“窗口期”較長的問題，我國自2010年開始，在采供血機構中引進核酸檢測，有效縮短了獻血者HCV篩查的“窗口期”[7]，從2015年血液篩查核酸檢測全面覆蓋，使我國輸血后HCV感染的殘余風險度下降到萬分之一以下[8]。但由于HCV病毒特點區別于HBV和HIV，HCV核酸檢測能力偏弱，存在漏檢風險。結果顯示抗-HCV篩查雙試劑反應性的15例標本，RIBA確證試驗陽性14例，核酸檢測陽性僅9例，即其余5例RIBA確認結果陽性，而獻血者HCV RNA未能檢出，與相關報道結果相近[5]，可能存在HCV既往感染，抑或隱匿性感染：血液中HCV RNA水平低于核酸檢測下限，表現為HCV RNA陰性[3]，也可能造成HCV輸血傳播風險，因此血液篩查核酸檢測不能完全替代血清學檢測。

HCV核心抗原幾乎與HCV RNA 同時出現，同樣具有彌補血液篩查“窗口期”漏檢的優勢[9]，但靈敏度比核酸檢測偏低，筆者認為更適合在未開展核酸檢測的地區進行大規模的血液篩查。有研究比較發現Murex Ag/Ab對抗體檢測的敏感性不如間接法Murex Ab試劑[10]，可能試劑微孔板包被的抗原或抗體性質有關。筆者認為我國血液篩查已全面核酸檢測的背景下，應用靈敏度較低的HCV Ag/Ab聯合試劑的意義不大，應著重考慮敏感性和/或特異性更好抗-HCV試劑結合核酸檢測進行血液篩查。

抗-HCV試劑從第一代僅包被NS4抗原片段，到第三代試劑（間接法）包被核心（結構區）和NS3、NS4、NS5（非結構區），增加了核心區C33的比重，因此敏感性大大提高，但仍未解決假陽性高的問題。結果顯示，c試劑單試劑反應性標本經核酸檢測全部陰性；RIBA確認試驗不確定5例，陰性15例。間接法單試劑陽性標本無確認陽性者，結合表1數據推斷，不論是進口還是國產試劑，間接法假陽性率明顯偏高，可能原因是血清中非特異性免疫球蛋白G（IgG）、類風濕因子干擾、超氧化物歧化酶干擾、用于試劑制備的抗原不純等因素均可造成假陽性[11]。較高的假陽性率不僅浪費寶貴的血液資源，也給獻血者造成不必要的困擾，因此對抗-HCV初篩反應性獻血者，應制定合理歸隊策略。

表1 2019年無償獻血者標本抗-HCV血液篩查情況

夾心法抗-HCV試劑（第4代）在檢測抗-HCV IgG的基礎上，增加了免疫球蛋白M（IgM）的檢測，不僅可以縮短窗口期，主要是將基因工程重組表達的抗原作為原料取代了酶標二抗，方法學上有了大幅改進，理論上可以大大提高檢測特異性。而且待檢樣本加樣量由間接法的10μL提高到50μL，降低了加樣誤差造成漏檢的可能。筆者對留取的61例間接法試劑（間接法）初篩陽性標本用夾心法試劑檢測，反應性17例，初篩試驗間接法雙試劑反應性的15例樣本全部檢出（確認結果陽性或不確定），說明其靈敏度能夠滿足采供血機構血液篩查的要求。其中46例間接法單試劑反應性標本中，僅有2例夾心法試劑檢測為反應性（確認結果陰性和不確定各1例），說明夾心法試劑的特異性明顯高于間接法試劑。在血液篩查中采用雙抗原夾心法試劑可以有效地降低假陽性率，為血液篩查工作提供更高的準確度，可以減少血液浪費，也避免為獻血者帶來不必要的心理負擔。

由本研究確認試驗結果可以看出雙試劑陽性的標本，其確證陽性的概率很高，留取的雙試劑陽性的標本15例，確認陽性14例（93.33%，14/15），而單試劑陽性的標本確證試驗陽性率較低。c試劑單試劑反應性標本確認試驗（RIBA）不確定樣本7例，主要以c22核心區條帶和NS3抗原條帶弱反應性為主，筆者認為假反應性概率較大，相關文獻報道抗-HCV確證結果為不確定的標本檢測的S/Co值分別＞8.0時預測為陽性獻血者的概率較大[12]。而這7例樣本用夾心法試劑檢測均為非反應性，這可能與試劑廠家包被抗原種類和工藝水平有關，這7例標本ELISA檢測的S/Co值普遍較弱，不排除假反應性的可能。表3中的5例不確定標本，反應條帶普遍較弱，且核酸檢測結果全部陰性，對于此類人群是否有HCV傳播風險，有待進一步進行隨訪和評估[6]。

綜上所述，筆者認為雙抗原夾心法（4代）抗-HCV血篩試劑靈敏度可靠，特異性明顯高于間接法試劑。獻血者HCV篩查中，核酸檢測不能完全取代血清學檢測，二者應相互補充，如果采用一遍酶免和一遍核酸的HCV篩查模式，采供血機構應根據本地區HCV流行情況合理選擇血篩酶免和核酸試劑組合，提高血液篩查檢測效能。針對抗-HCV初篩反應性獻血者，應進一步優化歸隊策略，為獻血者提供后續隨訪和合理的就診建議，對獻血者及時告知和關愛[13]，文章的研究結果可為獻血者歸隊策略指南的進一步優化提供數據參考。