18β-甘草次酸對失血性休克大鼠急性肺組織損傷及血氣變化的影響

姜現瑞，張娟娟，王 錦，單 芳，朱紹鳳，王 丹，趙均臣，丁歡歡

(河西學院醫學院，甘肅 張掖 734000)

失血性休克（hemorrhagic shock）是臨床上常見的危重病癥[1]，失血性休克/復蘇（hemorrhagic shock/resuscitation）后急性肺損傷（acute lung injury）一直是危重病醫學研究的熱點和難點[2]。國內外學者普遍認為[3，4]，肺是失血性休克后最易受損和最先出現癥狀的器官。通常機體因失血缺氧、全身組織和器官灌注不足，引起缺血組織氧化應激損傷[5]，并產生大量炎癥介質，導致急性肺損傷[6]，出現肺通氣異常、氣體交換障礙等，致死率很高[7]。如何預防和降低急性肺損傷，對降低失血性休克的死亡率和改善預后非常重要。甘草次酸是傳統中藥甘草中天然產物甘草酸的三萜苷元成分，具有抗炎[8]、抗病毒[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化和調節免疫[11]等多種作用。目前，甘草因其鎮咳、平喘、祛痰和肺保護等作用而廣泛用于治療呼吸系統疾病[12]?；诖耍狙芯恐荚谔接?8β-甘草次酸預處理對失血性休克大鼠肺組織損傷及血氣變化的影響，以期闡明中藥甘草次酸對失血性休克急性肺損傷的作用機制，為中藥針對休克后肺損傷患者的預防、恢復和輔助治療提供科學依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 18β-甘草次酸（18β-glycyrrhetinic acid，18β-Gly）（青島優索化學科技有限公司，批號：090229），2 g/瓶；氯化鈉（天津益仁達化工有限公司，批號：20160620），500 g/瓶；肝素鈉（北京索萊寶科技有限公司，貨號：H8060），1 g/瓶；無水乙醇（天津致遠化學試劑有限公司，批號：20210120），500 ml/瓶；甲醛（成都金山化學試劑有限公司，批號：20120912），500 ml/瓶；伊紅染液（珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA4098），500 ml/瓶；蘇木素（珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA4097），500 ml/瓶。

1.2 儀器 SPF 級動物配套用負壓換籠工作臺（SPFSA1）；BL-420F 生物信號采集系統（四川成都泰盟軟件有限公司）；PL2000 血氣酸堿分析儀（南京普朗醫療設備有限公司）；半自動石蠟切片機（德國SLEE）；組織脫水處理機（德國SLEE）；自動組織包埋機（德國SLEE）；離心機（無錫瑞江分析儀器有限公司）；高溫高壓滅菌鍋（日本Sanyo 公司）；恒溫水浴鍋（上海博訊醫療生物儀器股份有限公司）；普通冰箱（海爾集團）；微量移液器（200 μl）（Eppendorf公司）；干燥箱（上海儀器公司）。

1.3 實驗動物及分組 SD 雄性大鼠30 只，體重250～300 g，購自于中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心。隨機分為假手術組、實驗組[HS 模型組、18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）及18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）]，每籠6 只，飼養在室溫（24±1）℃，晝夜節律（白12 h/夜12 h）光照條件下，普通飼料喂養，自由飲水，適應性飼養7 d，實驗前12 h 禁食，自由飲水。實驗過程遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》要求進行。

1.4 失血性休克大鼠模型的建立 對假手術組、HS模型組、18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）及18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）進行實驗操作。采用右側頸靜脈插管，持續記錄中心靜脈壓波形及數據；左側頸總動脈插管，連續監測血壓，持續記錄收縮壓、舒張壓及平均動脈壓波形及數據；右側股動脈插管。待大鼠穩定后，經大鼠股動脈通道在10 min 之內勻速抽取血液誘發失血性休克，并通過放血使大鼠股動脈血壓維持在（35±5）mmHg，持續休克狀態180 min，以復制失血性休克大鼠模型。其中，18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）及18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）是將18β-Gly 按不同劑量（50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg）用0.9%的生理鹽水溶解后，于術前3 d（1 次/d）對大鼠灌胃，然后復制失血性休克大鼠模型。假手術組僅行頸靜脈、頸總動脈和股動脈插管，不放血。

1.5 濕/干比測定 動物處死后，立即開胸取肺，在游離主支氣管至環狀軟骨處剪斷氣管，剔除結締組織。取右肺上葉用濾紙吸干肺表面的液體，稱濕重（wet weight，W），然后放入恒溫干燥箱內，80 ℃烘烤2 d后，再稱干重（dry weight，D），計算肺組織濕/干比（W/D），判斷肺水腫情況。

1.6 肺組織HE 染色 取右肺中葉，置于4 ℃新鮮配制的中性多聚甲酸固定液中過夜，經全自動脫水機脫水、包埋、切片、HE 染色、封片后，采用數碼顯微攝像系統進行切片的圖像采集，觀察肺組織病變情況。

1.7 血氣分析 大鼠失血性休克3 h 后，于股動脈抽取0.5 ml 動脈血進行血氣分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析；計量資料以（P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓及中心靜脈壓比較 假手術組大鼠因未進行放血處理，實驗前后血壓及中心靜脈壓無明顯變化。實驗組通過股動脈放血誘導急性肺損傷后，HS 模型組、18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）和18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）失血性休克3 h 后血壓和中心靜脈壓較假手術組降低（P＜0.05），但18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）和18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）大鼠血壓與中心靜脈壓變化與HS 模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1、表1。

圖1 失血性休克大鼠血壓及中心靜脈壓變化情況

表1 各組大鼠中心靜脈壓和血壓比較（,mmHg）

表1 各組大鼠中心靜脈壓和血壓比較（,mmHg）

注：與假手術組比較，*P＜0.05

2.2 各組大鼠肺組織W/D 比較 18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）及18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）、假手術組肺組織W/D 低于HS 模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織W/D 比較

2.3 各組大鼠存活率比較 失血性休克3 h 后，18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）及18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）、假手術組大鼠存活率高于HS 模型組（P＜0.05），其中以18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）和18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）大鼠的存活率增加較為明顯，見圖3。2.4 各組肺組織病理學觀察結果比較 依據大鼠肺組織病理損傷情況，從肺泡壁充血水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚等方面進行分析，其中假手術組肺組織結構清晰，肺泡基本完整，肺泡壁未見炎癥充血水腫，比較正常，見圖4A；HS 模型組肺組織可見明顯的病理損傷，肺泡壁明顯炎癥充血水腫，肺泡間隔明顯增厚，見圖4B；18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）和18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）肺組織損傷較HS 模型組減輕，肺毛細血管擴張充血，肺泡間隔增厚，見圖4C、4D；18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）肺組織病理損傷較輕，肺泡結構基本完整，部分毛細血管擴張充血，肺泡間隔增厚不明顯，見圖4E。

圖3 各組大鼠存活率比較

圖4 各組大鼠肺組織病理變化（HE,×200）

圖4 各組大鼠肺組織病理變化（HE,×200）（續）

2.5 各組大鼠動脈血氣分析結果比較 18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）及18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）pH 和HCO3-高于HS模型組，而K+低于HS 模型組（P＜0.05），其中以18β-Gly 中劑量（100 mg/kg）和18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）變化較為明顯；此外，18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）及18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）PaO2高于HS 模型組，而PaCO2低于HS 模型組（P＜0.05），其中以18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）變化較為明顯，見表2。

表2 各組大鼠動脈血氣分析結果比較（）

表2 各組大鼠動脈血氣分析結果比較（）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與HS 模型組比較，#P＜0.05

3 討論

失血性休克是由于血管內血容量急劇減少導致器官組織灌注不足、氧供降低、細胞缺氧、體內免疫炎癥系統激活等一系列改變的臨床癥狀[13]。肺功能障礙是失血性休克最常見的并發癥，導致失血性休克患者致殘率和死亡率較高[14，15]?！渡褶r本草經》記載，甘草，味甘平，主五臟六腑寒熱邪氣，堅筋骨，長肌肉，金瘡解毒，久服，輕身延年[16]。甘草在臨床上廣泛應用于呼吸系統疾病的治療，其分解產物18β-甘草次酸，具有抗炎、抗氧化、抗癌、鎮咳平喘、鎮痛和調節免疫功能等多種作用[17，18]。

本研究通過建立失血性休克大鼠模型，首先觀察各組大鼠存活情況，結果發現隨著失血性休克時間的延長，大鼠存活率逐漸下降，死亡率逐漸升高，但采用甘草次酸預處理后的大鼠，其存活率明顯增加，由此推測18β-甘草次酸很可能通過減輕因失血性休克造成的急性肺損傷，進而提升存活率。此外，本研究通過股動脈采血，檢測各組大鼠血氣變化。動脈血氣分析是評價機體酸堿平衡狀態的重要方法，可以為組織器官的血流灌注和缺氧程度的評估提供可靠的參考指標。其中，PaO2和PaCO2主要代表酸堿平衡中的呼吸因素[19，20]，pH 和HCO3-主要反映代謝性酸堿中毒[21]。本研究結果顯示，HS 模型組大鼠pH 和HCO3-下降，K+升高，PaO2下降，PaCO2上升，這可能與失血性休克導致灌注不足、組織缺氧及酸性物質產生過多等使肺組織損傷（肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷），引起彌漫性肺間質充血水腫有關。與HS 模型組相比，18β-Gly 中劑量（100 mg/kg）和18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）pH和HCO3-升高而K+降低，18β-甘草次酸高劑量組（200 mg/kg）PaO2升高而PaCO2降低，這很可能與18β-甘草次酸改善酸堿平衡紊亂、緩解缺氧及降低血鉀濃度有關。

同時，本研究通過檢測右肺上葉肺組織W/D，觀察了各組大鼠失血性休克肺水腫情況，結果顯示18β-Gly 低劑量組（50 mg/kg）、18β-Gly 中劑量組（100 mg/kg）及18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）大鼠肺組織W/D 均不同程度減輕，由此研究得出18β-甘草次酸能夠減輕失血性休克后的肺水腫損傷程度。通過病理組織切片觀察各組肺組織形態學變化，也證實了這一點，經18β-甘草次酸預處理的各實驗組，其顯微鏡下肺組織形態與HS 模型組相比均有不同程度的減輕，而且以18β-Gly 高劑量組（200 mg/kg）的效果最為明顯。當然，失血性休克也是伴隨一系列炎癥反應的過程，大量炎癥因子和自由基產生，會引發機體“炎癥瀑布”[22]，導致急性肺損傷。本實驗研究只做了失血性休克大鼠模型，并未進行復蘇治療，旨在觀察18β-甘草次酸單因素對失血性休克后大鼠肺損傷的影響。下一步，課題組計劃通過提取動物血清和肺泡灌洗液以檢測失血性休克后相關炎癥因子的表達，進一步明確18β-甘草次酸對減輕失血性休克急性肺損傷其血氣變化和炎癥反應的具體機制。

綜上所述，18β-甘草次酸作為一種中藥制劑，具有減輕失血性休克大鼠肺組織病理損傷、改善動脈血氣變化的作用，并能有效提高失血性休克大鼠的存活率，但其具體機制仍有待進一步研究。