左歸丸對慢性睡眠剝奪老年大鼠學習記憶及海馬組織炎性因子的影響

劉家峰，胡金蓮，張 穎，劉展會

(西安市第九醫院中西醫結合康復科1，神經內科2，神經外科3，陜西 西安 710054)

慢性失眠（chronic insomnia）是指睡眠障礙持續6 個月以上，其特征為無法入睡或無法保持睡眠狀態，導致睡眠不足，又稱入睡和維持睡眠障礙。失眠是引起認知功能障礙的重要原因之一，尤其是慢性失眠的老年人，其認知功能損害的風險增加了將近2 倍[1]。目前對失眠引起的認知功能障礙的發病原因及發病機制尚不清楚。研究顯示[2，3]，慢性失眠的發病伴隨機體的慢性免疫炎性反應，海馬是學習記憶中樞，失眠可導致海馬依賴的學習記憶功能下降。炎癥因子可誘發海馬的小膠質細胞活化導致神經元的損傷[4，5]。中醫認為腦髓空虛是本病的基本病理變化，腎精虧虛是其基本病機。腎虛患者大多腦功能下降、大腦神經細胞減少、內分泌功能紊亂、炎性因子和變態反應增加，其中高炎性因子水平占主導地位[6，7]，從“陰虛”論治該病效果顯著。左歸丸是治療腎陰虛的代表方劑，用于改善認知功能療效顯著，但機制未明[8-10]。本實驗從慢性失眠炎性因子角度闡述左歸丸的有效性，為左歸丸介導調節睡眠防治認知障礙提供科學依據，旨在為臨床從睡眠預防認知障礙疾病的發生發展提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選40 只24 月齡老年Wistar 大鼠，全部雄性，購自西安交通醫科大學實驗動物中心。合格證號：SYXK（陜）2021-005。大鼠飼養于SPF 級實驗動物中心，給普通飼料。西安市第九醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物及試劑 D-半乳糖（上海試劑二廠生產，貨號A100028，規格：1 kg/袋），用生理鹽配成1.5%的溶液，4 ℃冷藏；咖啡因（美國Sigma 公司，規格：50 g/袋），用滅菌注射用水配成濃度為1.5%，4 ℃冷藏；左歸丸（北京同仁堂股份有限公司，國藥準字Z11020735，規格：54 g/瓶），將水丸研碎后溶于蒸餾水中制成0.3 g/ml 混懸液；艾司唑侖片（湖北制藥有限公司生產，國藥準字H42021522，規格：1 mg/片），將片劑研碎后溶于滅菌注射用水中制成1 g/ml 混懸液。白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢恩菲生物科技有限公司，貨號分別為ER1094、ER0042、ER0033；上海澤葉生物技術有限公司，貨號ZY-E6025R）。

1.3 儀器 電泳儀（上海天能科技有限公司，型號EPS300）；低溫高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司，型 號：GL-21MC）；水平搖床（北京六一儀器廠，型號WD-9405B）；電熱恒溫培養箱（上海博訊公司醫療設備，型號HXP-9052MBE）；恒溫水浴振蕩器（常州國華電器有限公司，型號：SHA-B）；高速電動勻漿機（江蘇金壇市環宇科學儀器，型號：FSH-Ⅱ）；全自動酶標儀（奧地利Antho-sLabtec Instruments，型號：anthos 2010）；電熱恒溫培養箱（上海博訊公司醫療設備，型號：HXP-9052MBE）；Morris 水迷宮（型號：上海移數鼠博士RD1101MWM-G）。

1.4 方法

1.4.1 分組及造模 40 只老年Wistar 雄性大鼠，適應性喂養1 周后，按照隨機數字表法分成正常組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組，每組8只。造模釆用D-半乳糖+咖啡因誘導：大鼠腹腔注射D-半乳糖60 mg/（kg·d）連續21 d，第21～28 天聯合腹腔注射咖啡因30 mg/（kg·d），第29～35 天采用旋轉圓筒方法行睡眠剝奪7 d。

1.4.2 給藥 灌服劑量根據實驗動物與人相同體表面積折算，即200 g 大鼠所需劑量相當于成人藥量×0.018。其劑量隨病鼠體重增加而適當增加飼服劑量。具體給藥量如下：中藥低劑量組：約6.89 mg/（kg·d）；中藥高劑量組：約20.66 mg/（kg·d）；西藥組：0.01 mg/（kg·d）；正常對照組與模型組每日灌服等體積雙蒸水，每日1 次灌胃，共灌胃14 d。灌胃期大鼠模型給藥、飼料及飲用水處理同前。

1.4.3 Morris 水迷宮實驗 第15 天給藥結束后進行Morris 水迷宮實驗。水迷宮共采用空間探查實驗和定位航行評價大鼠的學習記憶力。先做連續5 d 的適應性訓練，2 次/d，第6 天進行定位航行及空間探查實驗。具體方法為依次取各組大鼠進行水迷宮實驗，Morris 水迷宮設備由圓形的水池及水池上的攝像系統兩部分組成，在實驗前實驗者先把水池分為4 個象限，做好標記（N、W、S、E）；平臺放在1 個象限內，水池內放入水，水溫保持在24 ℃～26 ℃，水平面淹沒平臺，大鼠面朝水池壁依次從1 個依次從4 個點中的1 個放入，如在規定1 min 內找不到平臺則由實驗人員引導至平臺，并休息1 min，2 次/d，進行訓練5 d。第6 天開始進行測試。完成上述實驗后，進行空間探索，撤掉平臺，讓大鼠在水池內游泳，并記錄游泳穿過原所在平臺的次數。

1.4.4 ELISA 指標檢測 完成認知功能評價后，禁食不禁水24 h，處死全部大鼠，心臟取血，分離血清，取腦海馬組織均漿用于ELISA 檢測。實驗前用去離子水制備溶液僅配制實驗當天所需的足夠試劑，經加樣、洗板、上機等嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，最后讀取吸光度結果進行統計。

1.5 統計學方法 采用SPSS 26.0 統計學軟件分析。計數資料以（P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 左歸丸對老年慢性失眠大鼠睡眠時間、呼吸頻率、心率、收縮壓的影響 與正常組比較，模型組大鼠在呼吸頻率、心率、收縮壓均增多，睡眠時間減低（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組指標均有改善（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠睡眠時間、呼吸頻率、心率、收縮壓的比較（=8,）

表1 各組大鼠睡眠時間、呼吸頻率、心率、收縮壓的比較（=8,）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

2.2 左歸丸對老年慢性失眠大鼠學習記憶的影響與正常組比較，模型組大鼠穿越平臺次數減少，逃避潛伏期時間延長（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組大鼠穿越平臺次數增加，逃避潛伏期時間縮短（P＜0.05），西藥組大鼠穿越平臺次及逃避潛伏期時間無明顯變化（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠定位巡航及空間探索的比較（=8,）

表2 各組大鼠定位巡航及空間探索的比較（=8,）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

2.3 左歸丸對老年慢性失眠大鼠血清中IL-1、IL-6、IL-10 及腦組織中GDNF 的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1、IL-6 水平明顯升高，IL-10 水平明顯降低（P＜0.05），腦組織GDNF 水平明顯降低；與模型組比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組大鼠血清IL-1、IL-6 水平明顯降低，IL-10 水平升高，腦組織GDNF 水平升高（P＜0.05），西藥組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10 無明顯變化（P＞0.05），腦組織中GDNF 無明顯變化（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10、GDNF 比較（,ng/L）

表3 各組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10、GDNF 比較（,ng/L）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

3 討論

目前我國約有4.8%老年人患有不同程度認知損傷，并呈逐年年輕化的趨勢[11]。慢性失眠被認為是癡呆獨立危險因素，這種認知功能的損傷常常以記憶力減退及情感行為障礙為首發癥狀，目前認為與慢性失眠致認知功能障礙發生的機制有氧化應激、炎性反應、腦內的Aβ 及tau 蛋白的清除等因素，其介導的炎癥反應是多種神經系統發病的關鍵環節[1，2，12]。持續的炎癥狀態會導致大鼠行為學的改變，定位巡航、空間探索、學習記憶能力的減低[13-15]。這些異常與大腦海馬區的長時程（LTP）增強相關。本研究從慢性失眠狀態下致炎癥的角度闡述慢性失眠與認知功能障礙的關系。腦組織小膠質細胞處在激活期，釋放炎性因子IL-1β、IL-6，同時這種炎癥的級聯反應抑制小膠質的激活期，導致了IL-10、抑炎因子的減少，膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）分泌減少。小膠質細胞釋放毒性因子（IL-1、IL-6）、增強小膠質細胞的炎癥反應進而影響海馬的長時程改變[15，16]。

腦髓空虛是本病的基本病理變化，腎精虧虛是其基本病機。大量研究表明[7-9]，腎虛患者大多腦功能下降、大腦神經細胞減少、內分泌功能紊亂、炎性因子和變態反應增加，其中高炎性因子水平導致體內自由基的容量及過氧化物激增，加速了Aβ 在大腦的沉積。這些變化說明腎虛是癡呆的重要病因病機，始終貫穿老年性癡呆的整個病程，是其最本質的特征。只要以補腎填精益髓立方防治健忘癥，就能取得較好療效。慢性失眠作為原發病中醫病機以陰虛為本，尤以腎陰虛為突出的證候特點，臨床上從“陰虛”論治該病效果顯著。慢性失眠的病機為陰虛為本，燥熱為標，兩者互為因果，陰愈虛則燥熱愈盛，燥熱愈盛則陰愈虛，病變臟腑主要在肺、胃、腎，以腎為關鍵。慢性失眠的發生發展與腎陰虛衰密切相關。腎為先天之本，主藏精而寓元陰元陽，腎主骨生髓與腦髓密切相關，陰虛精虧髓減，清竅失充。明代醫學家張景岳從《小兒藥證直決》六味地黃丸中化裁出左歸丸，為滋腎補陰的代表方劑。左歸丸中的熟地、山藥、山萸肉、枸杞子、菟絲子、鹿角膠此六味藥物以甘溫性味為重，是填精補腎之上品。加入龜板膠、川牛膝重在滋陰補腎，填精益髓，方中鹿角膠、龜板膠，陰陽雙補，補陰藥中佐以扶陽藥，可起“陽中求陰”之效。諸藥合用，共奏滋腎補陰，益精填髓之功。

本實驗中模型組大鼠睡眠時間明顯減低，說明老年慢性失眠模型成立。Morris 水迷宮實驗是評價大鼠記憶能力的一個動物實驗指標，本實驗中模型組大鼠穿越平臺次數減少、逃避潛伏期時間延長提示慢性失眠大鼠存在記憶并能的減退，同時其血清IL-1、IL-6 水平升高、IL-10 水平降低，提示在模型組腦組織及血清中炎性指標異常，這與相關文獻報道一致[1，7]，最終導致腦組織中GDNF 水平降低，這可能是慢性失眠致記憶力減退的發病機制。在本實驗中觀察了中藥的有效性及與西藥比較的療效，結果顯示與模型組比較，中藥低、高劑量組在呼吸頻率、心率、收縮壓均、睡眠時間明顯均改善，穿越平臺次數增多，逃避潛伏期時間減少，血清IL-1、IL-6 水平降低，IL-10 水平升高，腦組織GDNF 水平升高。西藥組大鼠在穿越平臺次及逃避潛伏期時間無明顯變化，血清IL-1、IL-6、IL-10 無明顯變化，腦組織GDNF 無明顯變化。提示中藥及西藥組在改善睡眠方面均有療效，但在改善記憶功能方面，中藥療效優于西藥，同時也說明中藥左歸丸除了具有改善睡眠作用外，還具有改善慢性失眠大鼠記憶功能的作用。

綜上所述，老年慢性失眠致認知功能障礙與腎陰不足，腦虛髓減有關，滋腎補陰，益精填髓為治療慢性失眠致認知功能障礙的有效方法，但療效機制不清楚，仍有待進一步研究。本研究從炎性因子角度闡述了經方左歸丸治療老年慢性失眠致認知功能障礙，驗證了左歸丸可改善老年大鼠水迷宮穿越平臺次數及逃避潛伏期時長、改善睡眠時間，可能與其降低血清IL-1、IL-6，上調IL-10，盡而改善大鼠腦組織中GDNF 水平有關。