右美托咪定緩解膿毒癥引起的心臟功能障礙的機制研究

于 杰，姚 剛，趙 嵐，林 生

(煙臺山醫院東院心血管內二科，山東 煙臺 264003)

膿毒癥（sepsis）是感染引起的，機體對感染的失控反應所導致的可以威脅生命的器官功能障礙，嚴重者可危及生命。流行病學研究顯示[1]，膿毒癥在全世界范圍內的死亡率約為30%。在美國其每年新發的病例可達百萬例，死亡率為15%～30%。據我國調查顯示[2]，在所有ICU 住院的患者中，膿毒癥患者約占37.5%，其死亡率接近30%[1]。膿毒癥所造成的疾病負擔已經超過超過急性心肌梗死和心力衰竭。臨床和基礎研究表明，膿毒癥會造成機體多組織、器官繼發性損傷，心血管系統是主要的受累系統，隨著病情惡化，導致死亡率升高。目前，針對膿毒癥的治療，國際指南做出了如下推薦[3]：早期診斷，盡快去除感染灶，及時的液體復蘇，生命體征監護和臟器支持治療。但即使給予及時有效的治療措施，膿毒癥的死亡率仍在20%以上[4]。膿毒癥是否預后良好主要取決于機體是否存在臟器損害，而在膿毒癥造成的臟器功能損害中，心臟損害占50%以上，其主要表現為心臟射血分數降低、舒張功能障礙、左心室舒張末期內徑顯著增大，心動過速，心輸出量降低等。研究提示[5]，出現心臟損害的膿毒癥患者死亡率達50%。因此，糾正并存的心臟損害對改善膿毒癥預后意義顯著。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，是美托咪定的活性右旋異構體[6]，被推薦用于膿毒癥患者。DEX 不僅具有鎮靜、鎮痛、抗焦慮、抗交感、穩定血流動力學的作用，還具有心臟保護作用[7-9]。研究表明[10，11]，DEX 在心臟缺血再灌注損傷中通過抑制心血管交感神經反應穩定血流動力學，能夠改善心臟缺血損傷。此外，DEX 還可減輕內毒素引起的氧自由基的產生和促炎因子的釋放，并進一步抑制炎癥介質的放大效應[12]。作為膿毒癥的主要特征，許多炎癥因子如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達顯著增加，而DEX 能夠降低這些炎癥因子表達水平。有體外試驗表明[13]，膿毒癥模型可誘導原代小膠質細胞NLRP3 炎癥小體的活化。然而DEX 在膿毒癥導致心臟損傷中是否通過抑制NLRP3 炎癥小體活化進而抑制炎癥反應尚有待研究。為此，本研究通過建立大鼠膿毒癥模型，探討DEX 緩解膿毒癥引起的心臟功能障礙的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 大鼠30 只，雄性，SPF 級，體重200～240 g，1 個半月齡，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證為SCXK（京）2020-0003。所有大鼠在本單位動物房飼養，飼養溫度控制在22 ℃～24 ℃，相對濕度為50%～60%，室內光照維持12 h/12 h 晝夜交替，清潔安靜、通風良好，自由飲食，飼養1 周后用于實驗。本實驗所采用動物實驗方案通過動物倫理委員會審核。

1.2 主要試劑與藥物 DEX；血清IL-6、TNF-α 試劑盒、心肌酶肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）酶聯免疫吸附試劑盒均購自于北京索萊寶科技有限公司。NLRP3 抗體、Caspase-1、IL-1β 抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 高速低溫離心機購自德國Sigma 公司，BL-420E 生物機能實驗系統，通用型電泳儀、電泳及轉膜裝置均購自美國Bio-Rad 公司，Tanon 5200 化學發光分析系統購自上海天能生物科技有限公司，-80 ℃超低溫冰箱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，Beckman 255 型自動pH 計購自美國Beckman 公司，METTLER TOLEDO 高壓蒸汽滅菌器購自瑞士METTLER 公司，ZE260 微量電子天平購自杭州匯爾儀器設備有限公司，恒溫培養搖床購以及玻璃勻漿器購自南通市衛寧實驗器材有限公司。

1.4 模型制備與分組 將30 只SD 大鼠按照隨機數字表法為空白組（CON 組）、模型組（CLP 組）以及DEX 干預組（DEX 組），各10 只。空白組給予正常飼喂不做任何處理。DEX 組與CLP 組于術前12 h 停止進食，腹腔麻醉應用2%戊巴比妥鈉，采用盲腸結扎穿孔法（CLP）制備模型。術后均于大鼠背部皮下注射1 ml 生理鹽水補充容量，之后仍予正常飲食。膿毒癥大鼠模型成模標準：術后6～12 h，大鼠出現寒戰、高熱（肛溫≥40 ℃）、尿少、呼吸急促、萎靡少動等現象即造模成功。成模以后進行給藥，以0.9%氯化鈉溶液溶解右美托咪定，以30 μg/kg 的劑量腹腔注射，CON 組和CLP 組以等劑量的0.9%氯化鈉溶液腹腔及尾靜脈注射，1 次/d，持續3 d。

1.5 血流動力學指標測定 大鼠麻醉后仰臥位固定，行氣管插管，連接呼吸機，經左頸動脈管進入左心室腔內行總動脈插管，并于另一端連接壓力換能器，通過生物機能實驗系統進行左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室收縮末壓（LVSP）、平均動脈壓（MAP）值記錄。

1.6 血清生化指標檢測 大鼠眼眶取血，于4 ℃下3000 r/min 離心，靜置，取上層血清于EP 管中，置于-80 ℃保存備用。IL-6、TNF-α、CK、LDH 檢測嚴格按照相應的劑盒說明書操作，測定質量濃度。

1.7 NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 抗體檢測 Western blot 法測定炎癥蛋白含量，稱取50 mg 大鼠心臟組織，用預冷的PBS 緩沖液漂洗2～3 次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中；加入組織蛋白提取試劑，冰浴徹底勻漿；置于離心管中冰浴30 min，注意應用移液器進行吹打以保證勻漿液裂解；離心并收集上清液后，應用BCA 蛋白質濃度測定試劑盒進行樣品蛋白濃度的測定，此時保證每個樣品總蛋白上樣量為40 g；于上述樣品中加入適量蛋白上樣緩沖液，于100 ℃沸水中煮5 min；配膠采用5%濃縮膠與8%、10%、12%、15%、18%、20%的分離膠，電泳分離；轉膜后加入封閉液室溫封閉1 h；根據抗體說明書分別進行一抗孵育、二抗孵育，一抗以后進行3次洗膜，二抗以后在搖床上洗4 次，每次均為5 min；加入新鮮配置的ECL 混合溶液，根據不同光強度調整曝光條件，顯影、定影，同時采用自發光操作對NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 的蛋白表達量進行測量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行數據分析，計量資料采用（P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟血流動力學指標比較 與CON 組比較，CLP 組血流動力學指標均有不同程度的降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與CLP 組比較，DEX組心臟血流動力學指標（LVSP、LVEDP、MAP）有所改善，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組心臟血流動力學指標比較（,mmHg）

表1 各組心臟血流動力學指標比較（,mmHg）

注：與CON 組比較，a P＜0.05；與CLP 組比較，b P＜0.05

2.2 各組大鼠IL-6、TNF-α 比較 與CON 組比較，CLP 組IL-6、TNF-α 水平均有所升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與CLP 組比較，DEX 組IL-6、TNF-α 水平有所下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠IL-6、TNF-α 比較（,ng/L）

表2 各組大鼠IL-6、TNF-α 比較（,ng/L）

注：與CON 組比較，a P＜0.05；與CLP 組比較，b P＜0.05

2.3 各組大鼠CK、LDH 比較 與CON 組比較，CLP組CK、LDH 均有所升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與CLP 組比較，DEX 組CK、LDH 有所下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠CK、LDH 比較（,IU/L）

表3 各組大鼠CK、LDH 比較（,IU/L）

注：與CON 組比較，aP＜0.05；與CLP 組比較，bP＜0.05

2.4 各組大鼠NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 蛋白表達比較 與CON 組比較，CLP 組NLRP3、Caspase-1以及IL-1β 蛋白表達含量均有所升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與CLP 組比較，DEX 組NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 的蛋白水平則有所下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 蛋白表達比較（）

表4 各組大鼠NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 蛋白表達比較（）

注：與CON 組比較，a P＜0.05；與CLP 組比較，b P＜0.05

3 討論

膿毒癥導致的全身器官功能障礙是患者死亡的主要原因之一。雖然對膿毒癥的研究已有2000 年的歷史，但膿毒癥的發病率并沒有出現下降的趨勢。臨床研究發現，患有心臟損害的膿毒癥患者死亡率要顯著高于沒有心臟損害的患者。膿毒癥引起的心臟損害主要表現為心臟血流動力學變化以及相關炎癥因子的表達，如TNF-α 等炎癥因子水平增加、心臟功能改變等。炎癥是膿毒癥的首要特征。本研究發現，CLP 組小鼠LVEDP、LVSP、MAP 均有不同程度下降，心肌酶譜指標中CK 含量以及LDH 含量均增高，且血清指標IL-6 以及TNF-α 水平均有所增高，表明CLP 造模可引起大鼠心臟功能改變以及心肌細胞炎癥損傷，提示膿毒癥引起的心臟功能障礙模型造模成功[14]。研究表明，氧化應激和炎癥反應是膿毒癥導致心臟損傷的主要致病機制。已有體外試驗證明脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導原代小膠質細胞NLRP3 炎癥小體的活化[15]。DEX 是臨床醫學中常用的藥物，除具有鎮靜、止疼作用外，還具有抑制交感興奮、調節免疫、抗感染等多重作用。DEX能夠改善膿毒癥所導致的心臟損傷，但具體機制尚不清楚。本研究在CLP 造模成功基礎上，給予DEX治療，結果表明，相比于CLP 組，DEX 組大鼠心臟血流動力學指標（LVEDP、LVSP、MAP）有所下降（P＜0.05）；同時，DEX 組小鼠的心肌酶譜指標CK 及LDH 也有所下降（P＜0.05），提示DEX 治療后能夠改善損害心臟的血流動力并恢復心臟功能。另外，本研究對DEX 組大鼠的血清炎癥指標IL-6 以及TNF-α進行了評價，結果提示DEX 能夠降低膿毒癥引起心臟損傷的炎癥反應，與Zeng X 等[16]的研究結果一致。有研究提示NLRP3 炎癥小體能夠被激活進而釋放炎癥因子表達，其在心臟損傷的過程中發揮重要作用，機體在受到相應刺激時會過度活化NLRP3 炎癥小體，使NLRP3 寡聚化，并與ASC 作用募集pro-Caspase-1，進而激活Caspase-1，引起IL-1β 前體（pro-interleukin-1β）活化產生IL-1β，從而產生炎癥反應，促進心肌重構，推動心臟病病程[17，18]。因此，抑制NLRP3 炎性小體活化，能夠減輕炎癥反應，進而明顯改善膿毒癥對心肌的重構作用。在本研究中，CLP 組中大鼠的NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 蛋白表達水平均有所升高，而DEX 組NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 蛋白表達水平則有所下降，表明DEX 能夠通過阻斷NLRP3 炎性小體的形成和活化在CLP 導致心臟損傷的過程中發揮重要作用。

綜上所述，DEX 能夠改善膿毒癥大鼠的心臟血流動力學參數和心肌損傷程度。此外，DEX 能夠降低血清中TNF-α、IL-6 水平，也可以降低心肌CK、LDH 水平，提示DEX 誘導膿毒血癥大鼠心肌損傷大鼠的炎性改變，同時誘導心臟組織NLRP3、Caspase-1 以及IL-1β 表達的下調，這意味著DEX 可能通過抑制炎癥信號通路的方式對膿毒癥大鼠心肌組織起到保護作用。因此，DEX 在CLP 誘導的膿毒癥心臟損傷中可能通過抑制NLRP3 炎癥小體活化及下游IL-1β 以及炎癥因子的表達，從而發揮心臟保護作用。