NLRP3 炎癥小體基因在HPV 感染子宮頸細胞中的表達差異研究

毛 煥，潘建立，王長友

(天津市薊州區人民醫院病理科1，普外科2，天津 301900)

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種常見的性傳播病毒，大多數女性一生中會感染HPV。HPV 病毒持續感染、病毒載量持續高水平在宮頸癌癌前病變及病情發展中起重要作用[1]。Nod 樣受體蛋白3（Nod like receptor protein 3，NLRP3）是廣泛存在于腫瘤細胞的炎癥小體，由NLRP3、含CARD 結構域的細胞凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing，ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）組成，其效應分子為IL-18 和IL-1β。研究表明[2]，炎癥小體在多種疾病中扮演重要角色。Takano K 等[3]研究發現，NLRP3 在HPV 感染的口咽鱗狀細胞癌中強表達，但NLRP3 相關炎癥蛋白表達與HPV 感染之間沒有相關性。研究發現[4，5]，NLRP3 對HPV 持久性和降低感染高危HPV 的風險具有顯著相關性，然而，NLRP3 炎癥小體基因在不同HPV 感染的子宮頸細胞中的表達是否有差異尚無共識。基于此，本研究探討NLRP3 炎癥小體相關基因在子宮頸HPV 感染者中的差異表達，以期為HPV 感染的宮頸病變的分子生物學研究和內在機制研究提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年1 月-2020 年1 月在天津市薊州區人民醫院進行常規HPV 檢測者2983例，根據檢測結果分為正常組（無HPV 感染，1222例）、低危HPV 組（1023 例）、高危HPV 組（738 例），對低危HPV 組和高危HPV 組患者進行陰道鏡檢查并進行陰道鏡下子宮頸組織活檢。HPV 分型檢測者納入標準：有性生活史；智力正常；無陰道疾病手術；無子宮頸、子宮和盆腔手術史；無其他腫瘤及免疫性疾病等病史；取材前3 個月內無子宮頸局部治療；取材前24 h 內無陰道沖洗、無陰道內用藥、無婦科檢查及無性生活。排除標準：近1 周內使用抗生素；急性生殖道炎癥；有子宮頸手術史；月經期、妊娠期、產褥期以及哺乳期；有盆腔放化療治療史；生殖道畸形；嚴重的內科疾病；長期使用免疫抑制劑或皮質類固醇激素。所有入選者年齡17～81 歲，平均年齡（40.60±8.70）歲，剔除標本不滿意及重復送檢者。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HPV 亞型檢測 充分暴露子宮頸，用無菌鹽水棉球輕輕擦去子宮頸表面分泌物，再使用專用的取樣刷在子宮頸外口處以同心圓方式同方向轉動5 圈，采集宮頸脫落上皮細胞標本，立即將收集到的細胞存放于標記有患者相關信息的試管中，置于4 ℃保存液，密封。在管壁上充分洗脫宮頸刷后擠干，將洗脫液置于1.5 ml 離心管，12 000 r/min 離心10 min，去掉上清液后留取管底的細胞沉淀，加50 μl 細胞裂解液，沸水浴加熱10 min。13 000 r/min 離心10 min，保留上清液以備后面進行PCR 擴增。取1 μl 作為DNA 模板，PCR 反應總體系為25 μl，包含：1 μl DNA 模板、PCR-Mix（1 人份用量19.25 μl）、Taq 酶（1 人份用量0.75 μl）、ddH2O（1 人份用量4 μl），其余以雙蒸水補充至25 μl。PCR 反應條件：95 ℃預變性2 min，再95 ℃中20 s、55 ℃中30 s、68 ℃中20 s，進行40 個循環。將擴增后的產物于沸水浴中加熱變性10 min，然后進行冰浴，并且固定在有核酸探針的膜固定在雜交儀上進行預雜交，然后將擴增產物加到薄膜上，將樣品流入到膜內進行導流雜交，雜交結束后洗去未雜交的DNA，封閉膜，孵育5 min，重復進行2 次，排出封阻液以后在25 ℃時加入0.5 ml酶標液，溫育3.5 min。用沖洗緩沖液徹底洗膜4 次，0.8 ml/次，除去未結合的酶標液，最后加入0.5 ml NBT/BCIP 溶液蓋上蓋板顯色5 min，泵出NBT/BCIP溶液并用沖洗緩沖液徹底洗膜3 次，1 ml/次，再用2 ml 蒸餾水沖洗，然后關泵，取出雜交膜放在吸水紙上，于1 h 內分析結果。結果判斷：肉眼觀察膜條HPV 分型分布圖，根據藍紫色圓點判斷為何種HPV感染，若有一個分型點出現藍紫色則為單一感染，一個以上分型點出現藍紫色則為多重HPV 感染。高危型HPV 感染包括單一高危型HPV 陽性，高危型和低危型HPV 同時陽性和多重高危型HPV 陽性。低危型HPV 感染為單一低危型HPV 陽性和多重低危型HPV 陽性。

1.2.2 陰道鏡檢查及子宮頸組織活檢 受檢者于月經干凈后3～7 d 進行陰道鏡檢查，檢查前24 h 內禁行任何陰道操作（包括沖洗、檢查、性生活等）。采用RCI 評分診斷宮頸病變[6]。擦拭子宮頸表面分泌物，調焦后于陰道鏡下觀察子宮頸表面的顏色、上皮的狀態、病變的邊緣和血管形態，涂3%醋酸后觀察上皮顏色改變和血管收縮情況，涂碘觀察著色情況。每項0～2 分，4 項得分之和為RCI 得分，結果：0 分為正常或慢性宮頸炎；1～8 分為子宮頸上皮內瘤變（CIN）。凡RCI 評分≥1 分者在可疑病變區陰道鏡下取活檢送病理檢查，病理檢查由本院病理科完成。

1.2.3 隨訪 對低危HPV 和高危HPV 患者進行2 年的隨訪，隨訪結束后再進行陰道鏡檢查和子宮頸組織活檢，最后結果按是否出現CIN 再分為CIN 組和non-CIN 組。

1.2.4 RT-PCR 檢測NLRP3 及相關基因mRNA 表達情況 提取子宮頸組織RNA：將約0.15 g 的組織樣本至液氮中研成粉末，取約0.1 g 至1 ml 的Trizol，搖勻后靜置15 min，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，除去不溶物后，余下粉末加入0.2 ml 蛋白酶裂解液，繼續研磨至溶液澄清，4 ℃14 000 r/min 離心5 min取上清，加入200 μl 氯仿，劇烈震蕩呈乳糜狀于37 ℃靜置5 min 后放于預冷至4 ℃的低溫離心機，15 000 r/min 離心10 min，將無色上清轉移至EP 管中，加入等量預冷的異丙醇，混勻后室溫靜置10 min，于4 ℃的低溫離心機，15 000 r/min 離心10 min，棄去上清，加入1 ml 85%乙醇，混勻后室溫靜置5 min，于4 ℃的低溫離心機，15 000 r/min 離心5 min，棄去上清，留白色沉淀，待乙醇完全揮發后白色沉淀接近完全透明狀，加入50 μl 水溶解（無RNA 酶），55 ℃孵育10 min。RNA 逆轉錄合成cDNA：NLRP3 炎癥小體相關基因逆轉錄引物序列見表1，在0.2 ml 的PCR 管中配逆轉錄反應體系 [0.5 μg RNA，Oligo（dT）、PrimeScript RT、Random 6 mers 各0.5 μl，5×PrimeScript Buffer 2 μl，加R NaseFree dH2O 至10 μl]，混勻后12 000 r/min 離心2 min 置于PCR 儀上，37 ℃溫浴15 min，85 ℃加熱5 s，稀釋至35 μl，得到逆轉錄的cDNA。PCR 總反應體系10 μl，上下游引物 各0.4 μl，cDNA 1 μl，DEPC 水3.2 μl，SYBR-Green Master Mix 5 μl，95 ℃預變性60 s，95 ℃變性15 s，62 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，38 個循環，40 ℃降溫10 s。分析RT-PCR 結果，計算目的基因的表達水平。目的基因的表達水平為參照內參GAPDH 計算所得的相對值，目的基因mRNA 表達水平相對值=2-ΔΔCt（ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct 值，ΔΔCt=ΔCt 實驗組樣品-ΔCt對照組樣品）。

表1 NLRP3 炎癥小體相關基因引物序列

1.2.5 Western blot 檢測NLRP3 相關基因蛋白表達將子宮頸組織放入研缽中加入液氮研磨至粉末，再加入蛋白裂解液繼續研磨成勻漿，4 ℃12 000 r/min離心10 min 獲得上清液。經BCA 法蛋白濃度測定后將不同樣品平衡至同一濃度，再加入等體積的5×SDS 上樣緩沖液，沸水中煮5 min，立即冰浴5 min，再4 ℃12 000 r/min 離心5 min。取上清進行電泳，經SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳至溴酚藍到達膠的底端處停止電泳。再經200 mA 恒流轉膜1.5 h，將PVDF 膜放入5%BSA 中室溫封閉1 h，棄去封閉液，使用TBST 洗膜1 次，5 min，將PVDF 膜放入5 ml一抗稀釋液中，4 ℃孵育過夜。再用TBST 洗膜3 次，10 min/次。將ECL 均勻的涂在目的條帶附近，經暗室壓片曝光顯影、定影、掃描，最后采用全能型凝膠成像分析系統（Bio-Rad ChemiDoc MP）進行蛋白顯影照相，將目的蛋白與內參β-actin 灰度值的比值進行半定量分析。

1.3 統計學方法 實驗數據采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，計量資料采用（P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料比較 各組吸煙史、受教育程度、飲酒史、性伴侶、絕經、避孕措施比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組一般資料比較[,（%）]

表2 各組一般資料比較[,（%）]

表2 （續）

2.2 各組NLRP3 炎癥小體相關基因mRNA 和蛋白表達比較 低危HPV 組和高危HPV 組NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NF-κB 的mRNA 和蛋白表達水平均高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），但3 組ASC 的mRNA 表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），而蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1、圖2、表3、表4。

圖1 RT-PCR 檢測各組NLRP3 炎癥小體相關基因mRNA 的表達

圖2 Western blot 檢測各組NLRP3 炎癥小體相關基因蛋白的表達

表3 各組NLRP3 炎癥小體相關基因mRNA 的表達比較（）

表3 各組NLRP3 炎癥小體相關基因mRNA 的表達比較（）

表4 各組NLRP3 炎癥小體相關基因蛋白的表達比較（）

表4 各組NLRP3 炎癥小體相關基因蛋白的表達比較（）

2.3 隨訪結束后NLRP3 炎癥小體相關基因mRNA和蛋白的表達情況 低危HPV 組有409 例患CIN，占39.98%，高危HPV 組有421 例患CIN，占57.04%。隨訪結束后對其再次進行NLRP3 炎癥小體相關基因mRNA 和蛋白的表達水平分析，結果顯示：兩組CIN 組的NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NF-κB和ASC 的mRNA 和蛋白表達水平均高于non-CIN組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5、圖3。

圖3 隨訪后Western blot 檢測低危、高危HPV 組NLRP3 炎癥小體相關基因蛋白的表達

表5 隨訪結束后低危、高危HPV 組NLRP3 炎癥小體相關基因mRNA 和蛋白的表達情況（）

表5 隨訪結束后低危、高危HPV 組NLRP3 炎癥小體相關基因mRNA 和蛋白的表達情況（）

3 討論

研究發現[7，8]，90%以上的宮頸癌前病變以及宮頸癌患者宮頸組織可檢測到HPV 感染，高危型HPV 持續感染可導致宮頸上皮細胞異常增殖，促使子宮頸癌前病變甚至宮頸癌的發生。目前臨床尚無清除HPV 的特效藥。因此，研究HPV 感染宮頸細胞的分子生物學行為，對于開發清除HPV 藥物，解除其對宮頸病變的威脅具有重要意義。

子宮頸感染HPV 后產生炎癥是一種保護策略，如果炎癥短暫且控制良好則是有益的[9]。炎性小體Caspase-1、IL-1β、IL-18 參與機體炎性反應與免疫應答，誘導細胞焦亡，快速啟動誘導抗腫瘤的天然免疫，對抗腫瘤的形成。NLRP3 炎癥小體激活能夠促進炎癥因子及炎癥介質的釋放，引發炎癥反應發生。由于多種類型的病原體和危險信號能夠激活NLRP3 炎癥小體，因此它在多種疾病中發揮作用。NLRP3 刺激后通過接頭蛋白ASC 招募pro-caspase-1 形成炎癥小體，活化的NLRP3 炎癥小體可以促進Caspase-1 的活化，而Caspase-1 活化后可以切割IL-1β 和IL-18 的前體，介導IL-1β 以及IL-18的成熟和分泌，進而促進炎性因子的釋放，增強炎癥反應，發揮對RNA 和DNA 病毒強有力的清除作用。有研究認為[10]，NLRP3 在宮頸癌中主要通過ROS 模型激活從而誘導宮頸癌細胞焦亡。另外研究發現宮頸癌細胞較正常宮頸上皮細胞釋放的IL-18、IL-1β多[11]。同時也有研究認為當腫瘤進展時，宮頸癌中IL-1β 基因的表達在轉錄水平被下調，其他重要因子如IL-18 的表達亦被下調[12]。可見前人對于IL-1β和IL-18 在宮頸癌中的表達水平研究存在分歧。本研究結果顯示，隨著子宮頸細胞感染HPV 危險型別的增加，IL-1β 和IL-18 的mRNA 和蛋白的表達水平也呈上升趨勢。IL-18 可通過經典的炎癥小體途徑Caspase-1 對其前體剪切修飾后成熟釋放。蔣維等[13]研究發現，IL-18 的表達與HPV 感染和癌癥的發生呈正相關，IL-18 分泌量的變化可能在宮頸癌發生發展過程中發揮作用。本研究結果顯示，NLRP3和Caspase-1 在低危HPV 組和高危HPV 組的表達水平呈上升趨勢，IL-18 的水平也呈上升趨勢，該結果支持蔣維的觀點[13]。同時，本研究結果顯示，高危HPV 組隨訪2 年后發現有57.04%的患者患有CIN，而低危HPV 組有39.98%的患者患有CIN。已有研究認為[14-16]，HPV16 持續感染是殘留或復發CIN 的危險因素。宮頸病變甚至宮頸癌的發生是HPV 高危亞型16、18 和其它類型的混合感染交織在一起共同作用，很顯然，要明確這些不同高危亞型之間的作用關系，需要進一步深入研究。此外，本研究對研究對象進行一般臨床資料比較時發現，各組吸煙史、受教育程度、飲酒史、性伴侶、絕經、避孕措施比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。已有研究顯示[17，18]，在高危HPV 感染中與性伴侶的數量、吸煙具有顯著相關性。同時也提示不潔性行為對HPV 的傳播具有重大影響，這也已經在有關研究中被報道[19，20]。此外，吸煙可能通過激活單核細胞NLRP3 炎癥小體信號通路，促進單核細胞募集，引起血管炎癥損傷。

綜上所述，NLRP3 炎癥小體相關基因的異常表達可能是HPV 感染子宮頸細胞發生病變的關鍵因素，有可能作為HPV 感染子宮頸細胞發生病變的預測標志物。