黑質區過表達TFEB對C57/BL6小鼠運動功能影響

［摘要］目的探究黑質區過表達轉錄因子EB（TFEB）對C57/BL6小鼠運動功能的影響。方法8周齡雄性C57/BL6小鼠30只，隨機分為2組，每組15只。采用腦立體定位注射方法，將攜帶有TFEB的腺相關病毒（AAV-TFEB）注射至實驗組小鼠黑質區，對照組小鼠注射相同劑量的空載腺相關病毒（AAV-mCherry）。4周后，采用免疫熒光和免疫印跡方法檢測小鼠黑質區是否高表達TFEB，利用曠場、轉棒和爬桿實驗評估高表達TFEB小鼠的運動功能變化。結果腦立體定位注射腺相關病毒4周后，可檢測到小鼠黑質區高表達TFEB。曠場實驗顯示，實驗組小鼠的運動總距離較對照組增加，差異具有統計學意義（t=2.776，Plt;0.05），兩組小鼠通過中心區域次數差異無顯著性（t=1.414，Pgt;0.05）。轉棒實驗顯示，兩組小鼠運動疲勞狀態差異無顯著性（t=1.017，Pgt;0.05）。爬桿實驗顯示，兩組小鼠的運動協調能力差異無顯著性（t=0.264，Pgt;0.05）。結論黑質區高表達TFEB能夠增強C57/BL6小鼠的持續運動能力。

［關鍵詞］轉錄因子；黑質；運動活動；小鼠

［中圖分類號］R338.2［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0325-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.093［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230807.0920.004;2023-08-0716：36：25

EFFECTS OF OVEREXPRESSION OF TRANSCRIPTION FACTOR EB IN THE SUBSTANTIA NIGRA ON MOTOR FUNCTION IN C57/BL6 MICE" LIU Lin， CHEN Leilei， XIE Junxia （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of overexpression of the transcription factor EB （TFEB） on motor function in C57/BL6 mice. MethodsThirty 8-week-old male C57/BL6 mice were randomly divided into two groups， with 15 mice in each group. The experimental group received stereotactic injection of an adeno-associated virus carrying the TFEB gene （AAV-TFEB） into the substantia nigra. The control group received injection of the same dose of an empty adeno-associated virus （AAV-mCherry）. After four weeks， the presence or absence of high TFEB expression in the substantia nigra was determined by immunofluorescence assay and Western blot. The motor function of mice with high TFEB expression was evaluated by using the open field， rotarod， and pole tests. ResultsHigh expression of TFEB was detected in the substantia nigra four weeks after stereotactic injection of AAV-TFEB. The open field test showed that the total distance of movement of the mice in the experimental group was significantly increased compared with that of the control group （t=2.776，Plt;0.05）， with no significant difference in the frequency of center square entries （t=1.414，Pgt;0.05）. In the rotarod test， there was no significant difference between the two groups in fatigue resistance （t=1.017，Pgt;0.05）. In the pole test， there was no significant difference in the motor coordination ability of the two groups （t=0.264，Pgt;0.05）. ConclusionOverexpression of TFEB in the substantia nigra could enhance the persistent motor function of C57/BL6 mice.

［KEY WORDS］transcription factors; substantia nigra; motor activity; mice

帕金森病（PD）是第二大常見的與年齡相關的神經退行性疾病，其主要的臨床癥狀為靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和姿勢不穩[1-4]。隨著年齡的增加，不同的鐵復合物會在與運動和認知障礙相關的大腦區域積聚[5]，造成PD病人的行為運動障礙，而溶酶體在細胞鐵運輸和體內鐵平衡中起著關鍵作用[6-7]。轉錄因子EB（TFEB）是調節溶酶體再生和自噬的主要轉錄調節因子[8]。已有研究結果表明，高表達TFEB能夠逆轉溶酶體的功能，在神經退行性疾病中發揮神經保護作用[9-11]，是預防或者治療PD的有效策略之一。目前，已報道的實驗研究主要集中在TFEB如何影響溶酶體的生成及如何清除病理性蛋白聚集[12]，TFEB是否影響運動行為尚不清楚。本實驗室前期研究表明，TFEB可能使細胞內鐵儲存能力增強，從而保護細胞免受鐵死亡的影響[13]。本實驗旨在評估TFEB對小鼠運動功能

326青島大學學報（醫學版）59卷

的影響，從而為防治PD的運動功能障礙提供實驗依據。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物7周齡的SPF級C57/BL6小鼠30只，購于北京維通利華實驗技術有限公司。小鼠每5只一籠，飼養于室溫（21±2）℃、濕度（50±5）%、12/12 h晝夜循環光照條件下，可自由飲水和攝食，飼養到8周齡。

1.1.2主要試劑腺相關病毒（AAV）購于和元生物技術（上海）股份有限公司，加入1×PBS無菌緩沖液將空載AAV（AAV-mCherry）和攜帶有TFEB的AAV（AAV-TFEB）稀釋到相同的滴度。TFEB抗體購于Proteintech公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體和羊抗兔二抗購于愛必信（上海）生物科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自康為世紀；酪氨酸羥化酶（TH）抗體購于默克（Millipore）生命科學有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1黑質區立體定位注射將小鼠放入動物麻醉機（瑞沃德）誘導盒中，輸入異氟烷與空氣（1∶1）的混合氣體，當小鼠深度麻醉后，迅速將小鼠固定在腦立體定位儀上，調小異氟烷與空氣輸入量后持續供給。使用耳桿適配器固定小鼠頭部，調節門齒的高度使小鼠頭部平整，使耳桿適配器兩側讀數一致。用剪刀剪去小鼠頭頂的毛發，棉簽蘸取碘附消毒后用手術剪剪開頭部皮膚，將顱骨外側暴露出來。用過氧化氫溶液和生理鹽水擦拭頭皮后，參照小鼠腦立體定位圖譜，在臺式雙目體視顯微鏡（瑞沃德）下定位前囟和后囟，計算黑質區坐標。使用超微量注射器（World Precision Instruments）在兩側黑質區注射AAV，對照組注射AAV-mCherry，實驗組注射AAV-TFEB，每側黑質區注射200 nL，注射流量為1.0 nL/s，注射完成后留針10 min。退針后，用碘附消毒傷口，縫合并打耳洞做好標記，將小鼠放在電暖氣旁等待蘇醒，蘇醒后送回動物房正常飼養，4周后進行行為學實驗。

1.2.2曠場實驗將高40 cm、底部邊長40 cm、內壁為黑色且不透明的小鼠曠場反應箱，置于運動軌跡采集攝像頭的正下方，鏡頭距離反應箱底部高度為2 m。打開動物運動軌跡采集軟件（EthvisionXT 7）并設置相關參數后進行實驗。整個實驗在安靜穩定的環境下進行。通過觀察小鼠在曠場反應箱中運動總距離和通過中心區域次數對其自主運動能力進行評價。

1.2.3轉棒實驗測試儀器為Med Associates Inc公司生產的轉棒儀，將小鼠放在勻速轉動儀器上適應1 min，之后啟動測試，儀器以4～40 r/min速度轉動，記錄小鼠在轉棒上的持續運動時間，測試總時長為5 min。測試3次，每次間隔30 min以上，取平均值。

1.2.4爬桿實驗爬桿裝置（瑞沃德）為一根直徑0.8 cm、長50 cm、頂部帶有直徑3 cm圓球的木桿，用醫用膠帶纏繞其表面，防止小鼠打滑，其底部帶有金屬底座，放置于長100 cm、寬50 cm的白色塑料盒中，在里面加入 2/3的新墊料。實驗前1 d，對所有實驗小鼠進行適應性訓練，第2天正式實驗時，將小鼠放置在桿的小球處，頭部向下，記錄小鼠向下運動到底部的時間。共進行3次實驗，取平均值。

1.2.5免疫熒光染色病毒注射4周后，每組取6只小鼠，完全麻醉后迅速行腹腔灌注，斷頭取腦，用40 g/L多聚甲醛固定。沉糖使小鼠腦完全脫水下沉之后進行冷凍切片。切好的腦片置于0.01 mol/L PBS中，室溫下在搖床上清洗10 min去除包埋劑。干凈的腦片放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次10 min，用封閉液封閉1 h，隨后將腦片分別置于配制好的TH和TFEB一抗稀釋液中，4 ℃搖床上孵育過夜；用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次10 min，加入二抗稀釋液，在室溫下于搖床上避光孵育2 h；加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色液，繼續孵育5 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次10 min。將處理好的腦片平鋪到干凈的病理防脫載玻片上，用甘油封片，避光放置。最后用Olympus數字病理切片掃描系統熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.6免疫印跡法檢測TFEB蛋白表達小鼠灌注取腦后，迅速取出兩側黑質組織，按照組織質量加入配制好的裂解液，在冰上裂解30 min，放入組織研磨儀中研磨，取出后靜置30 min，放入提前預冷至4 ℃的離心機中，以12 000 r/min離心30 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE凝膠，在80 V恒電壓下跑膠，恒電流300 mA 90 min轉膜。轉膜結束以后用50 g/L脫脂奶粉配制的封閉液封閉1 h。加入TFEB（1∶1 000）一抗，在恒溫搖床上4 ℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次，每次10 min。加入山羊抗兔（1∶10 000）的HRP-IgG二抗，室溫下孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。加入發光液后應用美國UVP凝膠成像系統采集圖像。用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3統計學處理

采用GraphPad Prism 7軟件進行統計分析，實驗結果以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1病毒在小鼠腦中的表達位置

腦組織免疫熒光染色結果顯示，對照組和實驗組的AAV熒光可以與TH的綠色熒光共定位，提示AAV可在黑質區的多巴胺能神經元內表達。

2.2TFEB在小鼠黑質區中的表達

免疫印跡結果顯示，對照組和實驗組小鼠黑質區組織中TFEB蛋白的表達水平分別為0.484 2±0.037 3和0.896 2±0.064 3（n=6）。與對照組相比，實驗組小鼠黑質區TFEB蛋白表達水平明顯上升，差異具有統計學意義（t=5.544，Plt;0.05）。提示腦立體定位注射AAV-TFEB至小鼠黑質區4周后，可在多巴胺能神經元內有效高表達TFEB。

2.3高表達TFEB對小鼠運動功能的影響

曠場實驗結果顯示，實驗組小鼠的運動總距離較對照組增加，差異具有統計學意義（t=2.776，Plt;0.05），兩組小鼠通過中心區域次數差異無顯著性（t=1.414，Pgt;0.05）。轉棒實驗結果顯示，兩組小鼠運動疲勞狀態差異無顯著意義（t=1.017，Pgt;0.05）。爬桿實驗結果顯示，兩組小鼠的運動協調能力差異無顯著性（t=0.264，Pgt;0.05）。見表1。

3討論

PD的臨床癥狀分為運動癥狀和非運動癥狀，運動癥狀是其典型表現[14-15]。而黑質多巴胺能神經元的丟失、α-突觸核蛋白聚集和鐵沉積這些PD的主要病理特征往往在運動障礙出現之前就已經形成[16-20]。鐵參與大腦中的許多基本生物過程，包括氧氣運輸、DNA合成、線粒體呼吸、髓磷脂合成以及神經遞質合成和代謝[5]。鐵穩態是維持正常生理腦功能所必需的，而鐵穩態的失調可以通過不同的機制引起神經毒性[5，21-22]。當鐵穩態失調時，很容易誘發鐵死亡，鐵死亡是一種依賴于細胞內鐵積累而引起毒性脂質過氧化物活性氧升高的非凋亡細胞死亡形式[23-25]。在PD病人中，大量的鐵在腦區聚集，所產生的反應性物質能夠誘發脂質過氧化，進而加劇氧化應激，誘導腦中多巴胺能神經元的丟失。以上研究表明，鐵在神經系統中發揮著重要作用，調節鐵的代謝或可成為防治PD的有效策略之一。

TFEB是堿性螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈轉錄因子MiT/TFE家族的成員。MiT/TFE家族成員在很多細胞過程中都發揮關鍵作用，包括自噬-溶酶體生物發生[26-27]。有研究表明，高表達的TFEB能夠促進溶酶體再生，而自噬和溶酶體通過降解鐵蛋白參與鐵死亡的誘導過程[6]。另有研究表明，海藻糖也可以通過TFEB促進自噬，改善多種神經退行性疾病模型中的疾病表型[28]。因此，TFEB是否可以通過影響腦內鐵代謝從而影響PD的運動功能值得進一步探索。

本實驗在C57/BL6小鼠黑質區腦立體定位注射AAV-TFEB 4周后，對小鼠進行行為學測試。爬桿實驗用來評估運動協調能力，轉棒實驗用來評估運動疲勞，結果顯示，兩組小鼠運動協調能力和運動疲勞差異均無顯著性。曠場實驗用于觀察小鼠在新環境中的自主運動行為，小鼠水平運動的總距離能夠反映其運動能力，在中心區與外周區的通過次數和停留時間則反映其焦慮情況。本實驗結果顯示，高表達TFEB的小鼠無焦慮情況，但運動總距離顯著增加，說明小鼠的運動能力增強，高表達TFEB可以調節小鼠的運動能力。結合已有研究結果，推測TFEB可能使細胞內鐵儲存能力增強，從而保護細胞免受鐵死亡的影響，進而影響PD運動障礙的形成。

綜上所述，TFEB能夠調節小鼠的運動功能，但它是否對PD模型小鼠的運動功能障礙具有保護作用仍需要進一步研究。

［參考文獻］

[1]KELLY J， MOYEED R， CARROLL C， et al. Gene expres-sion meta-analysis of Parkinson’s disease and its relationship with Alzheimer’s disease[J]." Molecular Brain， 2019，12（1）：16.

[2]CERRI S， MUS L， BLANDINI F. Parkinson’s disease inwomen and men： what’s the difference[J]？ Journal of Parkinson’s Disease， 2019，9（3）：501-515.

[3]RAZA C， ANJUM R， SHAKEEL N U A. Parkinson’s di-sease： mechanisms， translational models and management strategies[J]." Life Sciences， 2019，226：77-90.

[4]REICH S G， SAVITT J M. Parkinson’s disease[J]." The Me-dical Clinics of North America， 2019，103（2）：337-350.

[5]WARD R J， ZUCCA F A， DUYN J H， et al. The role of iron in brain ageing and neurodegenerative disorders[J]." Lancet Neurol， 2014，13（10）：1045-1060.

[6]RIZZOLLO F， MORE S， VANGHELUWE P， et al. The lysosome as a master regulator of iron metabolism[J]. Trends in Biochemical Sciences， 2021，46（12）：960-975.

[7]YAMBIRE K F， ROSTOSKY C， WATANABE T， et al. Impaired lysosomal acidification triggers iron deficiency and inflammation in vivo[J]." eLife， 2019，8：e51031.

[8]MEDINA D L， PAOLA S D， PELUSO I， et al. Lysosomal calcium signalling regulates autophagy through calcineurin and TFEB[J]. Nature Cell Biology， 2015，17（3）：288-299.

[9]TORRA A， PARENT A， CUADROS T， et al. Overexpression of TFEB drives a pleiotropic neurotrophic effect and prevents Parkinson’s disease-related neurodegeneration[J]. Molecular Therapy： the Journal of the American Society of Gene Therapy， 2018，26（6）：1552-1567.

[10]XIAO Y S， CHEN X， HUANG S X， et al. Iron promotes α-synuclein aggregation and transmission by inhibiting TFEB-mediated autophagosome-lysosome fusion[J]. Journal of Neurochemistry， 2018，145（1）：34-50.

[11]ZHUANG X X， WANG S F， TAN Y， et al. Pharmacological enhancement of TFEB-mediated autophagy alleviated neuronal death in oxidative stress-induced Parkinson’s disease models[J]. Cell Death amp; Disease， 2020，11（2）：128.

[12]SARDIELLO M， PALMIERI M， RONZA A D， et al. A gene network regulating lysosomal biogenesis and function[J]." Science， 2009，325（5939）：473-477.

[13]馬月，陳蕾蕾，謝俊霞. 轉錄因子EB對Erastin誘導鐵死亡的影響[J]. 青島大學學報（醫學版）， 2022，58（3）：325-328.

[14]BOUGEA A. New markers in Parkinson’s disease[J]. Advances in Clinical Chemistry， 2020，96：137-178.

[15]HAYES M T. Parkinson’s disease and Parkinsonism[J]. The American Journal of Medicine， 2019，132（7）：802-807.

[16]MAROGIANNI C， SOKRATOUS M， DARDIOTIS E， et al. Neurodegeneration and inflammation-an interesting interplay in Parkinson’s disease[J]." International Journal of Molecular Sciences， 2020，21（22）：8421.

[17]XU J H， HE X F， XU Y Q， et al. Characteristics of systemic inflammation and brain iron deposition in Parkinson’s disease patients[J]." Annals of Clinical and Translational Neurology， 2022，9（3）：276-285.

[18]JANKOVIC J， TAN E K. Parkinson’s disease： etiopathoge-nesis and treatment[J]." Journal of Neurology， Neurosurgery， and Psychiatry， 2020，91（8）：795-808.

[19]YASUHARA T. Neurobiology research in Parkinson’s disease[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2020，21（3）：793.

[20]KALIA L V， LANG A E. Parkinson’s disease[J]. The Lancet， 2015，386（9996）：896-912.

[21]WANG Z L， YUAN L， LI W， et al. Ferroptosis in Parkin-son’s disease： glia-neuron crosstalk[J]. Trends in Molecular Medicine， 2022，28（4）：258-269.

[22]YAN H F， ZOU T， TUO Q Z， et al. Ferroptosis： mechanisms and links with diseases[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2021，6（1）：49.

[23]HIRSCHHORN T， STOCKWELL B R. The development of the concept of ferroptosis[J]. Free Radical Biology and Medicine， 2019，133：130-143.

[24]LI D S， LI Y S. The interaction between ferroptosis and lipid metabolism in cancer[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2020，5（1）：108.

[25]MOU Y H， WANG J， WU J C， et al. Ferroptosis， a new form of cell death： opportunities and challenges in cancer[J]. Journal of Hematology amp; Oncology， 2019，12（1）：34.

[26]TAN A， PRASAD R， LEE C， et al. Past， present， and future perspectives of transcription factor EB （TFEB）： mechanisms of regulation and association with disease[J]. Cell Death and Differentiation， 2022，29（8）：1433-1449.

[27]NAPOLITANO G， BALLABIO A. TFEB at a glance[J]. Journal of Cell Science， 2016，129（13）：2475-2481.

[28]RUSMINI P， CORTESE K， CRIPPA V， et al. Trehalose induces autophagy via lysosomal-mediated TFEB activation in models of motoneuron degeneration[J]. Autophagy， 2019，15（4）：631-651.

（本文編輯馬偉平）