PD模型小鼠未定帶GABA能神經元的放電變化

［摘要］目的探討1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的帕金森病（PD）模型小鼠未定帶γ-氨基丁酸（GABA）能神經元的放電變化。方法8周齡雄性C57BL/6小鼠14只，隨機分為對照組及MPTP組，每組7只。MPTP組采用連續5 d腹腔注射MPTP（30 mg·kg^-1·d^-1）的方法制備PD小鼠模型，對照組注射等量生理鹽水。利用免疫熒光技術觀察小鼠黑質區酪氨酸羥化酶（TH）陽性神經元的數目變化，曠場實驗觀察小鼠運動行為變化，膜片鉗技術觀察未定帶區GABA能神經元的放電變化。結果與對照組相比，MPTP組小鼠黑質區TH陽性神經元數目明顯減少（t=2.775，Plt;0.05）；曠場檢測結果顯示，MPTP組小鼠在曠場中的運動距離較對照組明顯減少（t=17.870，Plt;0.001）；MPTP組小鼠未定帶區GABA能神經元放電頻率較對照組降低，差異具有統計學意義（t=5.895，Plt;0.001）。結論MPTP誘導的PD模型小鼠未定帶GABA能神經元放電頻率顯著降低。

［關鍵詞］帕金森病；未定帶；GABA能神經元；電生理學；小鼠

［中圖分類號］R338.2［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0345-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.096［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230804.1521.004;2023-08-0418：31：34

CHANGE IN GABAERGIC NEURON FIRING IN THE ZONA INCERTA IN A MOUSE MODEL OF PARKINSON’S DISEASE" LI Ang， CHEN Fenghua， WANG Zijun， SHI Limin （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the firing change of gamma-aminobutyric acid （GABA）-ergic neurons in the zona incerta in a mouse model of Parkinson’s disease induced by 1-methyl-4-phenyl-1， 2， 3， 6-tetrahydropyridine （MPTP）. MethodsFourteen 8-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into control group and MPTP group， with seven mice in each group. A MPTP model was prepared by intraperitoneal injection of MPTP （30 mg·kg^-1·d^-1） for continuous five days in the MPTP group. The control group was injected with an equal amount of normal saline. The number of tyrosine hydroxylase （TH）-positive neurons in the substantia nigra was determined by the immunofluorescence technique. The locomotor activity of mice was observed by the open field test. The firing change of GABAergic neurons in the zona incerta was measure using the patch clamp technique. ResultsCompared with that of the control group， the number of TH-positive neurons in the substantia nigra of the MPTP group was significantly reduced （t=2.775，Plt;0.05）. The MPTP group showed a significantly shorter distance of movement in the open field than the control group （t=17.870，Plt;0.001）. The firing rate of GABAergic neurons in the zona incerta was significantly lower in the MPTP group than in the control group （t=5.895，Plt;0.001）. ConclusionIn the MPTP-induced PD model in mice， the firing rate of GABAergic neurons in the zona incerta was significantly reduced.

［KEY WORDS］Parkinson disease; zona incerta; GABAergic neurons; electrophysiology; mice

帕金森病（PD）是一種常見的神經退行性疾病，主要發生于老年人[1]，其神經病理學基礎是黑質致密帶多巴胺能神經元選擇性丟失，紋狀體軸突末梢多巴胺含量減少，基底神經核直接和間接通路失平衡[2-3]，從而引起一系列運動癥狀，包括靜止性震顫、運動遲緩、僵硬和姿勢不穩等[4]。腦深部電刺激是臨床治療 PD 運動癥狀的高效治療手段，被認為能干預被刺激核團神經元的放電活動，并影響相關神經傳導通路的信息傳遞，從而調控腦區的功能[5]。丘腦底核和蒼白球內側部是最經典的刺激靶點，最近的研究表明未定帶也可作為腦深部電刺激的靶點，未定帶電刺激與丘腦底核電刺激相比效果相似甚至更優[6-8]，且無明顯副作用，病人術后吞咽、認知和語言功能均未受影響[9]。腦深部電刺激改善PD病人運動癥狀的機制可能是影響了神經元的放電活動[10]，但在PD狀態下未定帶神經元的放電是否發生了變化目前尚不清楚。本實驗選用神經毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）制備PD小鼠模型，利用腦片膜片鉗技術觀察其未定帶γ-氨基丁酸（GABA）能神經元的放電變化，為了解未定帶在PD進展和治療中的作用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑

SPF級8周齡C57BL/6小鼠，由北京維通利華公司提供。小鼠飼養于25 ℃、12 h晝夜循環光照條件下，可自由飲水、攝食、活動。動物手術符合青島大學動物倫理學要求。MPTP購自美國Sigma公司，酪氨酸羥化酶（TH）抗體購于美國Millipore公司。參考文獻方法配制人工腦脊液及冷凍切片液進行腦片膜片鉗實驗[11]。

1.2分組及給藥方法

將26只小鼠隨機分為對照組和MPTP組，每組13只，其中7只小鼠用于曠場實驗和免疫熒光實驗，6只小鼠用于腦片膜片鉗實驗。MPTP組小鼠連續5 d腹腔注射MPTP（30 mg·kg^-1·d^-1），對照組小鼠連續5 d腹腔注射等量生理鹽水。

1.3曠場實驗

在給藥結束24 h后進行曠場實驗，將小鼠放于曠場測試盒里，讓其自由活動，利用Ethvision XT7系統設定好曠場程序，將待測小鼠放在測試盒的中心位置，點擊開始，計時10 min記錄小鼠的運動情況。每次檢測結束后用體積分數0.75的乙醇及擦手紙擦拭，徹底清理測試盒，散去味道后開始下一只小鼠的測試，避免陌生味道對小鼠行為產生干擾。

1.4腦標本采集

曠場實驗結束之后進行腦標本的采集。麻醉小鼠，固定其四肢，暴露心臟，將靜脈注射針頭小心插入左心室同時剪開右心耳。先用9 g/L 的NaCl對小鼠進行灌注，再應用40 g/L的多聚甲醛溶液（用0.1 mol/L的PBS配制，pH值7.2～7.4，現用現配，4 ℃避光保存）對小鼠進行灌注。待小鼠肝臟由紅色變為黃白色且四肢和尾部出現僵直時，停止灌注操作。立刻取出小鼠大腦，在40 g/L多聚甲醛溶液中固定過夜，再用200 g/L蔗糖溶液（用0.1 mol/L的 PBS配制）脫水，大腦沉底后，轉入到300 g/L蔗糖溶液中脫水，大腦沉入底部提示脫水完成。

1.5腦組織切片及免疫熒光染色

用恒溫冷凍切片機（Leica，CM1950）進行冷凍切片。切片之前將機器預冷至-20 ℃，將腦組織用包埋劑OCT（Sakura Finetek）包埋并固定在凍頭托上。將小鼠腦組織切成厚度為20 μm的腦片，黑質區腦片切成完整的4套，將腦片置于含有0.01 mol/L PBS溶液的12孔板中放在4 ℃保存，進行免疫熒光實驗時取出完整的1套進行染色。使用TH一抗（稀釋比為1∶1 000，rabbit）和PBST稀釋的熒光二抗（donkey anti-rabbit 555，稀釋比為1∶500），參照文獻方法進行免疫熒光染色[12]。在Olympus光學顯微鏡下拍片，應用OlyVIA軟件進行計數。計數該套腦片在20倍物鏡下黑質區TH陽性神經元個數，再乘以4即可得到黑質區TH陽性神經元的個數。統計黑質區每個高倍視野（400倍）內的陽性細胞數目并取平均值。

1.6離體未定帶腦片制備及電生理學記錄

記錄電極由水平拉制儀拉制而成，尖端直徑為1～2 μm。選取電阻為 4～9 MΩ的玻璃電極進行實驗。參考文獻的方法進行離體未定帶腦片的制備及電生理學記錄[11]。

1.7統計學分析

應用Graph Pad Prism 6軟件進行統計學分析。實驗結果以±s表示，組間比較采用t檢驗。Plt;0.05 表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1PD模型小鼠黑質TH陽性神經元數目及運動行為的變化

免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比，MPTP組小鼠黑質區TH陽性神經元數目減少，差異具有統計學意義（t=2.775，Plt;0.05），提示小鼠出現黑質區多巴胺能神經元損傷。曠場實驗結果顯示，與對照組相比，MPTP組小鼠在曠場中的運動距離明顯減少（t=17.870，Plt;0.001），提示小鼠出現運動障礙，PD模型制備成功。見圖1及表1。

2.2PD模型小鼠未定帶GABA能神經元的放電變化

在全細胞記錄形成之后，轉為電流鉗模式，給予神經元-200 pA的超極化電流刺激，神經元膜電位未出現顯著的內向整流特征，且在Gap free模式下，神經元表現出較快且規則的自發放電活動，判斷為GABA能神經元[13]。本實驗記錄到的未定帶神經元放電頻率約為24.17 Hz，動作電位時程較短，半寬高為（1.36±0.65）ms，符合GABA能神經元的放電特征。本實驗在每組6只小鼠中各記錄10個神經元，對照組和MPTP組小鼠未定帶GABA能神經元放電頻率分別為（24.17±8.60）和（6.73±2.18）Hz，MPTP組小鼠未定帶GABA能神經元放電頻率較對照組顯著降低（t=5.895，Plt;0.001）。提示在PD狀態下，未定帶GABA能神經元放電活動發生了變化。見圖2。

3討論

未定帶是底丘腦的重要核團，被認為是中腦網狀結構的吻部延伸，主要含GABA能神經元[14]。在嚙齒類動物中，未定帶大致分為4個亞區（吻側區、背側區、腹側區和尾側區），各亞區與不同的大腦區域具有纖維聯系，如背側區和吻側區的GABA能神經元投射到皮質和丘腦，腹側區的GABA能神經元投射到基底前腦和腦干，尾側區接收來自小腦的纖維投射。此外，未定帶內部的GABA能神經元之間也有互相聯系[7]。通過復雜的纖維投射，未定帶在機體多種功能的調控中均發揮重要作用，影響攝食、姿勢與運動、睡眠與覺醒、大腦皮質發育、神經病理痛等多種生理病理過程[14-17]。

未定帶與PD的研究近年來也受到較多關注。有臨床研究觀察到，在未定帶實施腦深部電刺激術可顯著改善PD病人的運動癥狀[18]，這提示在PD疾病狀態下，未定帶神經元出現異常的電活動。已知大腦的許多功能都與神經元的電活動相關，腦深部電刺激術被認為能干預被刺激核團神經元的異常放電活動，并影響相關神經傳導通路的信息傳遞，從而調控腦區的功能[5]。本實驗首次在MPTP制備的PD模型小鼠中，利用腦片膜片鉗技術觀察比較未定帶GABA能神經元的自發放電活動變化。本研究首先通過免疫熒光染色觀察到黑質TH陽性神經元數目減少，證實多巴胺能神經元受損，曠場行為學檢測進一步證明PD模型建立成功，然后觀察到未定帶GABA能神經元自發放電頻率在模型小鼠中顯著降低。以往研究也表明，在PD動物模型中，多個與PD發病相關核團神經元的電活動都出現了變化。例如，內側蒼白球神經元放電頻率較正常動物增加20%～50%，其中爆發式的放電類型顯著增加[19]；PD大鼠模型中黑質網狀帶區GABA能神經元自發放電頻率顯著增高，并且簇狀放電的神經元增多[20]。但神經元電活動出現變化的具體機制還不明確，推測可能與離子通道的開放程度有關。探索PD狀態下神經元電活動的變化可為腦深部電刺激提供可選擇的刺激靶點。鑒于本團隊前期研究已經證實未定帶神經元數目在PD小鼠模型中減少[21]，我們推測，在PD狀態下未定帶神經元出現損傷，同時放電活動降低。本實驗為進一步了解未定帶神經元在PD中的病理改變提供了實驗依據。

［參考文獻］

[1]BLOEM B R， OKUN M S， KLEIN C. Parkinson’s disease[J]. Lancet， 2021，397（10291）：2284-2303.

[2]TAO M Z， DOU K X， XIE Y J， et al. The associations of cerebrospinal fluid biomarkers with cognition， and rapid eye movement sleep behavior disorder in early Parkinson’s disease[J]. Frontiers in Neuroscience， 2022，16：1049118.

[3]JELLINGER K A. The pathobiological basis of depression in Parkinson disease： challenges and outlooks[J]. Journal of Neural Transmission， 2022，129（12）：1397-1418.

[4]PAJARES M， I ROJO A， MANDA G， et al. Inflammation in Parkinson’s disease： mechanisms and therapeutic implications[J]. Cells， 2020，9（7）：1687.

[5]YUAN G H， ZHENG Y J， WANG Y， et al. Multiscale entropy and small-world network analysis in rs-fMRI-new tools to evaluate early basal Ganglia dysfunction in diabetic peripheral neuropathy[J]. Frontiers in Endocrinology， 2022，13：974254.

[6]BAUMGARTNER A J， THOMPSON J A， KERN D S， et al. Novel targets in deep brain stimulation for movement disorders[J]. Neurosurgical Review， 2022，45（4）：2593-2613.

[7]OSSOWSKA K. Zona incerta as a therapeutic target in Parkinson’s disease[J]. Journal of Neurology， 2020，267（3）：591-606.

[8]MARCO R D， BHARGAVA D， MACEROLLO A， et al. Could ZI have a role in DBS for Parkinson’s disease？ An observational study to optimize DBS target localization[J]. Journal of Clinical Neuroscience， 2020，77：89-93.

[9]PHILIPSON J， BLOMSTEDT P， FREDRICKS A， et al. Short- and long-term cognitive effects of deep brain stimulation in the caudal zona incerta versus best medical treatment in patients with Parkinson’s disease[J]. Journal of Neurosurgery， 2020，134（2）：357-365.

[10]AUBIGNAT M， LEFRANC M， TIR M， et al. Deep brain stimulation programming in Parkinson’s disease： introduction of current issues and perspectives[J]. Revue Neurologique， 2020，176（10）：770-779.

[11]CHANG X L， MA Z G， SHI L M， et al. Effects of ghrelin on the electrical activities of substantia nigra dopaminergic neurons treated with MPP[J]. Neurochemistry International， 2020，138：104780.

[12]IM K， MARENINOV S， DIAZ M P， et al. An introduction to performing immunofluorescence staining[J]. Methods in Molecular Biology， 2019，1897：299-311.

[13]TRAGESER J C， BURKE K A， MASRI R， et al. State-dependent gating of sensory inputs by zona incerta[J]. Journal of Neurophysiology， 2006，96（3）：1456-1463.

[14]YANG Y， JIANG T， JIA X Y， et al. Whole-brain connectome of GABAergic neurons in the mouse zona incerta[J]. Neuroscience Bulletin， 2022，38（11）：1315-1329.

[15]YE Q Y， ZHANG X B. Serotonin activates paraventricular thalamic neurons through direct depolarization and indirect di-sinhibition from zona incerta[J]. The Journal of Physiology， 2021，599（21）：4883-4900.

[16]OH S G， HWANG Y G， LEE H S. LIM homeobox 6 （Lhx6）+ neurons in the ventral zona incerta project to the core portion of the lateral supramammillary nucleus in the rat[J]. Brain Research， 2020，1748：147125.

[17]HU T T， WANG R R， DU Y， et al. Activation of the intrinsic pain inhibitory circuit from the midcingulate Cg2 to zona incerta alleviates neuropathic pain[J]. The Journal of Neuroscience， 2019，39（46）：9130-9144.

[18]STENMARK PERSSON R， NORDIN T， HARIZ G M， et al. Deep brain stimulation of caudal zona incerta for Parkinson’s disease： one-year follow-up and electric field simulations[J]. Neuromodulation， 2022，25（6）：935-944.

[19]HOOVER J E， STRICK P L. The organization of cerebellar and basal ganglia outputs to primary motor cortex as revealed by retrograde transneuronal transport of Herpes simplex virus type 1[J]. The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 1999，19（4）：1446-1463.

[20]BOLAM J P， HANLEY J J， BOOTH P A， et al. Synaptic organisation of the basal Ganglia[J]. Journal of Anatomy， 2000，196（Pt 4）：527-542.

[21]曹中凱，陳鳳華，謝俊霞，等. 帕金森病模型小鼠PV和NOS陽性神經元數目變化[J]. 青島大學學報（醫學版）， 2022，58（3）：345-348.

（本文編輯馬偉平）