Exendin-4及內源性GLP-1對大鼠海馬CA3區神經元自發放電的調控

［摘要］目的探究胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑Exendin-4及內源性GLP-1對海馬CA3區神經元自發放電的調控作用。方法利用在體細胞外單細胞電生理記錄方法，觀察三管微電極微壓力注射10 μmol/L Exendin-4和10 μmol/L Exendin-9-39（GLP-1受體阻斷劑）對大鼠海馬CA3區神經元自發放電頻率的影響。結果在記錄到的22個海馬CA3區神經元中，Exendin-4使17個神經元放電頻率顯著增高（t=6.286，Plt;0.01），平均升高（149.67±18.94）%，與生理鹽水組相比差異有顯著性（Z=3.571，Plt;0.01）。在記錄到的14個海馬CA3區神經元中，Exendin-9-39使10個神經元放電頻率顯著降低（t=7.968，Plt;0.01），平均降低（61.90±6.10）%，與生理鹽水組相比差異有顯著性（Z=3.145，Plt;0.01）。結論Exendin-4興奮海馬CA3區神經元，內源性GLP-1參與調節海馬CA3區神經元自發放電。

［關鍵詞］胰高血糖素樣肽1；艾塞那肽；CA3區，海馬；電生理學；大鼠

［中圖分類號］R338.2［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0353-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.074［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230719.1612.002.html;2023-07-2014：53：18

ROLE OF EXENDIN-4 AND ENDOGENOUS GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 IN REGULATING THE SPONTANEOUS DISCHARGE OF NEURONS IN THE HIPPOCAMPAL CA3 REGION OF RATS SUN Huizhe， LIU Cui， SHEN Fangshuai， CHEN Xinyi， XUE Yan， CHEN Lei （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the role of the glucagon-like peptide 1 （GLP-1） receptor agonist Exendin-4 and endogenous GLP-1 in regulating spontaneous discharge of neurons in the hippocampal CA3 region. MethodsIn vivo extracellular single-unit recordings were used to observe the effect of three-barrel glass micro-electrode micro-pressure injection of 10 μmol/L Exendin-4 versus 10 μmol/L Exendin-9-39 （a GLP-1 receptor antagonist） on the spontaneous discharge frequency of neurons in the hippocampal CA3 region. ResultsAmong the 22 neurons recorded in the hippocampal CA3 region， 17 showed a significant increase in spontaneous discharge frequency caused by Exendin-4 （t=6.286，Plt;0.01）， with a mean increase of 149.67%±18.94%， which was significantly different from that in the saline group （Z=3.571，Plt;0.01）. Among the 14 neurons recorded in the hip-pocampal CA3 region， 10 showed a significant reduction in spontaneous discharge frequency caused by Exendin-9-39 （t=7.968，Plt;0.01）， with a mean reduction of （61.90±6.10）%， which was significantly different from that in the saline group （Z=3.145，Plt;0.01）. ConclusionExendin-4 can excite neurons in the hippocampal CA3 region， and endogenous GLP-1 is involved in regulating the spontaneous discharge of neurons in the hippocampal CA3 region.

［KEY WORDS］glucagon-like peptide 1; exenatide; CA3 region， hippocampal; electrophysiology; rats

胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是一種腸道激素，由腸道L細胞合成并分泌，可通過血-腦脊液屏障。而腦內GLP-1陽性神經元主要位于孤束核，其纖維投射廣泛[1-3]。GLP-1受體是一種G蛋白耦聯受體，廣泛分布于包含海馬在內的腦內核團[4]。有研究表明，激活腦內GLP-1受體可起到調節攝食、神經保護和抗炎作用，并參與調節突觸可塑性。海馬是學習記憶以及認知功能的重要調節中樞[5]。根據神經元形態及神經纖維的構成不同，海馬可以分為CA1、CA2、CA3和CA4等區域。CA3區神經元的電活動參與編碼空間工作相關記憶[5]。有形態學研究表明，海馬CA3區高度表達GLP-1受體[2，6]。然而，GLP-1是否能調控海馬CA3區神經元自發放電尚不清楚。本研究旨在利用在體電生理記錄方法探討GLP-1受體激動劑Exendin-4及內源性GLP-1對大鼠海馬CA3區神經元自發放電的影響。現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗藥品

Exendin-4和Exendin-9-39（GLP-1受體阻斷劑）購于美國MedChemExpress公司，烏拉坦購于上海麥克林生化科技有限公司，乙酸鈉和滂胺天藍購于美國Sigma公司。

1.2動物處理

實驗用鼠為健康成年雄性Wistar大鼠，體質量250～320 g，由濟南市朋悅實驗動物繁育有限公司提供。大鼠飼養于（23±1）℃、12 h晝夜循環、濕度50%～60%的實驗環境中，可自由進食、飲水。在開始電生理實驗前大鼠適應環境1周。嚴格按照實驗醫學倫理學要求，盡量減少動物的使用數量及在實驗過程中的痛苦。

1.3在體細胞外電生理記錄

腹腔注射烏拉坦1 g/kg麻醉大鼠，將大鼠放置在帶有加熱器的立體定位儀中，保持溫度在36～38 ℃。根據大鼠腦圖譜，在海馬CA3區背側部位進行開顱手術（前囟后3.6～3.8 mm，旁開3.4～4.0 mm）。通過多管微電極拉制器拉制出三管微電極，其記錄電極中加入0.5 mol/L的乙酸鈉和20 g/L的滂胺天藍染料，另外兩個管為給藥電極，分別加入生理鹽水和Exendin-4，或生理鹽水和Exendin-9-39。生物電信號通過信號放大器和數模轉化器進行擴大，用Spike 2軟件記錄并分析神經元放電數據。當電極尖端到達海馬CA3區（顱骨外表面下2.5～3.2 mm）并且記錄到穩定的神經元自發放電5 min后，通過生物細胞納升注射器將上述藥物注射到神經元表面，觀察藥物對神經元放電頻率及放電模式的影響。神經元的基礎放電頻率為給藥前120 s的平均頻率，加藥后的反應頻率為加藥后反應高峰處50 s的平均頻率。如果給藥后神經元放電頻率的變化超過基礎放電頻率均數±2個標準差，則認為該神經元對該藥物有反應，否則認為該神經元為無反應神經元[7]。

1.4統計學分析

采用SPSS軟件進行統計學分析。所得計量數據以±s表示，神經元加藥前后的放電頻率比較采用配對t檢驗，兩組神經元自發放電頻率變化百分數比較采用曼-惠特尼秩和檢驗；對藥物不同反應神經元放電模式的比較采用Fisher精確檢驗。Plt;0.05認為差異有顯著性。

2結果

2.1Exendin-4對大鼠海馬CA3區神經元自發放電的影響

在記錄到的6個海馬CA3區神經元中，微壓力注射生理鹽水后，其放電頻率由（1.78±0.44）Hz變為（1.92±0.50）Hz，差異無統計學意義（t=1.277，P=0.274），放電頻率增加（11.59±7.47）%。微壓力注射10 μmol/L Exendin-4后，在所記錄到的22個海馬CA3區神經元中，Exendin-4顯著興奮17個神經元，其放電頻率由（1.74±1.49）Hz增加到了（3.83±2.60）Hz，差異具有統計學意義（t=6.286，Plt;0.01），放電頻率平均升高（149.67±18.94）%，與生理鹽水組相比差異有統計學意義（Z=3.571，Plt;0.01）。Exendin-4對另外5個海馬CA3區神經元的放電頻率無明顯影響，其放電頻率由（1.77±0.48）Hz變為（1.95±0.45）Hz，差異無統計學意義（t=2.221，P=0.091）。

此外，本實驗通過放電間隔直方圖和自相關圖對CA3區神經元的放電模式進行分析。共記錄到兩種CA3區神經元放電模式：簇狀放電和不規則放電。在Exendin-4產生興奮效應的17個神經元中，有11個神經元（64.7%）為簇狀放電，6個神經元（35.3%）為不規則放電；在對Exendin-4無反應的5個神經元中，有3個神經元（60.0%）為簇狀放電，2個神經元（40.0%）為不規則放電。CA3區神經元對Exendin-4的反應與神經元放電模式之間無明顯相關性（P=0.833）。對每個神經元放電間隔直方圖的自相關圖進行分析，結果顯示Exendin-4不改變神經元的放電模式。

2.2內源性GLP-1對海馬CA3區神經元自發放電的影響

微壓力注射生理鹽水使所記錄到的6個海馬CA3區神經元放電頻率由（1.95±1.72）Hz變為（2.09±2.22）Hz（t=0.497，P=0.674），平均變化（5.82±10.72）%。在所記錄的14個海馬CA3區神經元中，10 μmol/L的Exendin-9-39顯著降低10個神經元的放電頻率，其放電頻率由（1.92±0.75）Hz降低至（0.83±0.65）Hz（t=7.968，Plt;0.01），平均降低（61.90±6.10）%，與生理鹽水組相比差異有顯著性（Z=3.145，Plt;0.01）。Exendin-9-39對另外4個海馬CA3區神經元的放電頻率無明顯影響，其放電頻率由（1.85±0.25）Hz變為（1.80±0.36）Hz（t=0.515，P=0.176）。

3討論

海馬在記憶形成過程中占有核心地位，為信息的最初獲取和儲存提供了神經基礎[8]。CA3區神經元是海馬初級神經環路的重要組成部分，參與學習和記憶過程，尤其在突觸傳遞調節及認知功能中發揮重要作用[6，9]。當海馬CA3區錐體神經元發生變性及退變時，會引發神經退行性疾病，如阿爾茨海默病（AD）等。

GLP-1及其受體在大腦、胰腺、心臟、肌肉、腎臟中均有表達，具有廣泛的生理功能。在人類和小鼠中GLP-1生理濃度下，GLP-1受體可以激活G-蛋白Gαs，進而激活腺苷酸環化酶，導致細胞內環磷酸腺苷水平增加[10-11]。GLP-1/GLP-1受體也可以激活G_αi/O和G_αq/1，導致磷脂酶C的激活以及二酰甘油和蛋白激酶C活性的增加[10，12]。人體臨床試驗和動物模型實驗均表明，GLP-1參與能量代謝和攝食的調節，外周或中樞內的GLP-1可抑制攝食行為[13-14]。此外，在帕金森病（PD）動物模型中，GLP-1受體激動劑，如利西拉肽和利拉魯肽，發揮明顯的保護作用，可以改善PD模型小鼠運動能力[15]。另有研究報道，GLP-1受體激動劑利拉魯肽可以抑制AD模型小鼠β淀粉樣蛋白斑塊的沉積，改善莫里斯水迷宮測試的認知功能，改善認知障礙[16-17]。此外，FARKAS等[18]近期研究發現，激活小鼠下丘腦GLP-1受體可增加促性腺激素釋放激素神經元的放電頻率，提示GLP-1可能通過調節神經元自發放電而參與調控攝食行為。形態學研究表明，GLP-1受體在CA3區有高水平的表達，然而Exendin-4對于海馬CA3區神經元的直接電生理效應目前尚未見報道。本研究通過在體電生理實驗觀察到，微量注射Exendin-4可增強大鼠海馬CA3區神經元的自發放電活動，這為腦內海馬GLP-1/GLP-1受體系統提供了直接的功能性證據。

雖然沒有形態學證據揭示孤束核GLP-1纖維直接投射至海馬，但本研究觀察到微量注射GLP-1受體阻斷劑Exendin-9-39可以降低海馬CA3區神經元的自發放電頻率，這提示海馬CA3區的內源性GLP-1參與調控神經元的興奮性，增加其自發放電。以往也有報道稱內源性GLP-1發揮重要功能。例如，有研究顯示，攝食行為完成后，再次給予食物圖片可以明顯抑制參與食欲調節核團的活動，這種效應在很大程度上可以通過外周給予Exendin-9-39來阻斷，這表明內源性GLP-1在攝食行為中起關鍵作用[19]。此外，有研究發現，內源性GLP-1可以調節十二指腸運動和胰腺分泌，減少骨吸收[20-21]。有電生理實驗顯示，GLP-1受體阻斷劑Exendin-5-39可降低場興奮性突觸后電位衰減時間，抑制海馬齒狀回長時程抑制，調節海馬的突觸傳遞與突觸可塑性，進一步揭示了內源性GLP-1的緊張性作用[22]。由上述研究可見，內源性GLP-1與神經元自發放電、食物攝取行為、突觸傳遞和記憶形成都有著密切的聯系，其重要性不可忽視。

有功能學實驗研究結果表明，腦內直接給予Exendin-4可改善大鼠的空間記憶和工作記憶能力，抑制神經炎癥的發生和Tau蛋白過度磷酸化，進而改善AD[23-24]。近期有研究表明，Exendin-4可以逆轉PD模型小鼠黑質多巴胺能神經元的損傷，改善運動行為[25-26]。最近有研究指出，通過給予神經元溫和的光遺傳刺激或者興奮性神經遞質刺激，可以增加神經元興奮性，起到保護神經元延緩神經元死亡的作用[27]。本研究結果顯示，給予Exendin-4可直接興奮海馬CA3區神經元，提示腦內GLP-1對海馬CA3區神經元的直接興奮效應可能是其保護神經元及抗AD的途徑之一。

綜上所述，給予GLP-1受體激動劑Exendin-4可以增加海馬CA3區神經元的自發放電頻率，且內源性GLP-1亦參與調節海馬CA3區神經元的興奮性。本實驗結果為進一步探究GLP-1/GLP-1受體系統可能作為學習與記憶相關疾病的潛在靶點提供了一定的理論基礎和實驗依據。

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（本文編輯馬偉平）