μ-CnIIIC芋螺多肽二硫鍵異構體的合成鑒定及活性評價

張文杰 郭凱 張發進 王者江 董玉香 姬勝利

【摘 要】目的 對μ-CnIIIC芋螺多肽的3種二硫鍵異構體進行合成鑒定及生物安全性、活性評價。方法通過固相多肽合成法（SPPS）人工合成μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ線性肽；采用氧化法對線性肽進行氧化折疊，獲得3種折疊肽異構體（μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ），并對其進行質譜表征和HPLC純化；通過MTT法測試3種異構體的細胞毒性；采用雙電極電壓膜片鉗技術測試3種異構體對NaV1.2的抑制作用。結果 質譜表征結果顯示成功合成μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ 3種芋螺多肽異構體；μ-CnIIIC 3種異構體濃度在50 μmol/L范圍內時，細胞存活率均在75%以上且不發生溶血現象；μ-CnIIIC異構體濃度為20 μmol/L時，μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ對對鈉通道的抑制率為23.64%、52.43%、81.21%，皮膚刺激性實驗每天每只動物積分均值為0.107、0.179和0.286。結論 芋螺多肽μ-CnIIIC異構體具有良好的生物安全性，二硫鍵連接為Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ和Ⅲ-Ⅵ的μ-CnIIIC異構體對鈉通道有更好的選擇性，抑制作用較強，可發揮更好的生物活性。

【關鍵詞】μ-CnIIIC芋螺多肽；二硫鍵；鈉通道

中圖類分號：Q78 文獻標志碼：A 文章編號：1004-4949（2023）02-0001-05

Synthesis， Identification and Activity Evaluation of μ-CnIIIC Conopeptide Disulfide Bond Isomer

ZHANG Wen-jie1， GUO Kai2， ZHANG Fa-jin1， WANG Zhe-jiang2， DONG Yu-xiang1， JI Sheng-li1，2

[1.College of Pharmacy， Binzhou Medical University， Yantai 264003， Shandong， China； 2.ReaLi Tide Biological technology （Weihai） Co.， Ltd， Weihai 264402， Shandong， China]

【Abstract】Objective To study the synthesis， identification and activity of three disulfide bond isomers of μ-CnIIIC. Methods The linear peptides of μ-CnIIIC-Ⅰ， μ-CnIIIC-Ⅱ and μ-CnIIIC-Ⅲ were synthesized by solid phase peptide synthesis（SPPS）. Three-fold peptide isomers （μ-CnIIIC-Ⅰ， μ-CnIIIC-Ⅱ and μ-CnIIIC-Ⅲ） were obtained by oxidative folding of the linear peptides， which were characterized by mass spectrometry and purified by HPLC. The cytotoxicity of the three isomers was tested by MTT method. The inhibition effect of three isomers on NaV1.2 was tested by using double electrode voltage patch clamp technique. Results Mass spectrometry characterization results showed thatμ-CnIIIC-Ⅰ， μ-CnIIIC-Ⅱ andμ-CnIIIC-Ⅲ were successfully synthesized. When the concentration of three isomers of μ-CnIIIC was in the range of 50μmol/L， the cell survival rate was above 75% and no hemolysis occurred. When the concentration of μ-CnIIIC isomer was 20 μmol/L， the inhibition rates of μ-CnIIIC-Ⅰ， μ-CnIIIC-Ⅱ and μ-CnIIIC-Ⅲ on sodium channel were 23.64%， 52.43% and 81.21%， respectively. The average scores of skin irritation test were 0.107， 0.179 and 0.286 per animal per day. Conclusion The μ-CnIIIC isomers of conopeptides have good biosafety. The μ-CnIIIC isomers with disulfide bonds of Ⅰ-Ⅳ， Ⅱ-Ⅴ and Ⅲ-Ⅵhave better selectivity to sodium channels， stronger inhibitory effect and better biological activity.

【Key words】μ-CnIIIC conopeptide； Disulfide bond； Sodium channel

芋螺毒素（conotoxins，CTX）是來源于海洋芋螺毒液的一類活性多肽，又稱芋螺多肽。大多數芋螺多肽富含二硫鍵，具有特定的分子構型，能選擇性作用于細胞膜上特異的離子通道和受體等，具有激活乙酰膽堿受體等生物活性[1]。鈉通道廣泛分布于各種組織和器官中，參與多種生理過程，其功能異常會導致疼痛、癲癇、周期性麻痹等多種疾病發生，開發針對鈉離子通道的新型化合物有助于多種疾病的治療和新型藥物的開發[2]。芋螺含有超過上百萬的天然多肽類化合物，但迄今為止僅百余種多肽化合物被發現，具有很大的開發應用潛力[3]。μ-CnIIIC屬于μ類芋螺毒素，其為14至26個氨基酸殘基肽，共享CCXnCXnCXnCC的特定半胱氨酸框架[4]。二硫鍵（disulfide bond）是多肽鏈內或鏈間中的兩個半胱氨酸殘基側鏈的巰基氧化形成的共價鍵，μ類芋螺毒素具有6個半胱氨酸殘基的骨架，理論上可以形成15種不同的二硫鍵異構體。研究表明[5]，并非所有的“活性”芋螺多肽折疊是最有效的生物活性肽，而具有非天然二硫鍵連接的芋螺毒素優于天然的“活性”對應物；同時二硫鍵的結構對芋螺多肽的功效具有重要意義。為了解二硫鍵對芋螺多肽μ-CnIIIC異構體活性的影響，本研究采用固相法合成3種μ-CnIIIC異構體線性肽，并通過氧化法合成3種μ-CnIIIC異構體，對其細胞毒性、鈉通道活性進行研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8只實驗小鼠來源于濱州醫學院醫藥研究中心，所用小鼠均為（體重30～40 g）普通級雌性昆明小白鼠，并嚴格按照“動物實驗的護理和使用指南”飼養。8只實驗家兔來源于濱州醫學院醫藥研究中心，所用家兔均為普通級新西蘭白兔，并嚴格按照“動物實驗的護理和使用指南”飼養。

1.2 主要材料與試劑 二氯甲烷（DCM）及乙腈（旺通化工有限公司）；1-羥基苯并三唑（HOBT）、二異丙基碳二亞胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）及氨基酸（蘇州昊帆生物股份有限公司）；3，4，5-三羥基苯甲醛（麥克林生化科技有限公司）；三異丙基硅烷（Tis，湖北永闊有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，魯西化工基團股份有限公司）；Rink Amide 樹脂（上海聯邁生物工程有限公司）；RAW 264.7細胞（南京科佰生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）購于魯西化工基團股份有限公司；高糖DMEM培養液（山東致圣生物科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 智能磁力攪拌器（上海越眾有限公司，型號：ZNCL-BS 230*230）；高效液相色譜儀（美國Waters有限公司，型號：Waters-0150）；質譜儀（美國Waters有限公司，型號：Waters-2695）；旋轉蒸發儀（上海愛朗有限公司，型號：N-1300）；電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司，型號：101-2AB）；紫外分析儀（上海光豪有限公司，型號：ZF-5）；Axon Axoclamp 900A膜片鉗微電極放大器系統（美國Molecular Devices公司）；真空冷凍干燥機（青島永合創信電子科技有限公司，型號：CTFD-18）；高壓滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司，型號：San Yo MLS-3750）。

1.4 芋螺多肽合成 采用傳統Fmoc保護的固相多肽合成法合成[5]。采用可酰胺化的Rink Amide樹脂，并采用DCC、HOBT及DIEA為縮合體系，DMF為反應溶劑。線性肽合成后使用裂解溶液室溫下切割2 h，切割后的多肽釋置于甲基叔丁基醚中析出后經冷凍干燥，進行下一步氧化折疊；采用三步氧化法對線性肽進行氧化折疊，獲得μ-CnIIIC-Ⅰ（見圖1）、μ-CnIIIC-Ⅱ（見圖2）和μ-CnIIIC-Ⅲ（見圖3）3種折疊肽異構體，然后對其進行質譜表征和HPLC純化，合成產物凍干后分裝備用。

1.5 芋螺多肽表征 流動相采用乙腈-水（75∶25），流速為0.4 ml/min，柱溫30 ℃；進樣量為30 μl。采用電噴霧離子源，正離子模式，全掃描模式（Full Scan），掃描范圍m/z 400～2600，電噴霧電壓4500 V；加熱毛細管溫度380 ℃；毛細管電壓100 V；Tube lens 150 V；氮氣（N2）壓力30 arb；輔助氣（N2）壓力10 arb；二級離子采用碰撞誘導解離（collision-induced dissociation，CID）采集數據。

1.6 生物相容性研究 生物相容性是驗證化合物能否作為候選藥物的重要指標，因此對3種多肽的溶血活性和細胞毒性進行研究。用熒光顯微鏡觀察紅細胞形態，分析其溶血活性。測定3種多肽對動物細胞的細胞毒性[6]。8只實驗小鼠分為a、b、c、d 四組，每組2只。4組小鼠分別尾靜脈注射生理鹽水（NS）0.2 ml和3種芋螺多肽0.2 ml（8 mg/kg）進行溶血試驗，2 h后從小鼠眼眶取血2滴，分別用生理鹽水稀釋，熒光顯微鏡下觀察紅細胞形態。用MTT法測定3種多肽對小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW 264.7細胞）的細胞毒性。將RAW 264.7細胞（約2000個細胞）接種于96孔板，然后置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，使細胞粘附。將不同濃度的芋螺多肽經多次稀釋后加到細胞培養液中孵育24 h。孵育完成后，吸掉上清液，每孔加入150 μl DMSO溶解溶液，37 ℃下孵育2 h；然后通過酶標儀測量450 nm處的吸光度強度，確定3種多肽的細胞毒性。每個測試至少重復3次。

1.7 電生理活性檢測 使用自動全細胞膜片鉗檢測μ-CnIIIC 3種異構體對鈉離子通道抑制作用。首先將鈉通道穩定表達的HEK293細胞系培養在10%的胎牛血清和DMEM高糖培養基（含10% FBS和1%雙抗）中，置于5% CO2，37 ℃培養箱中培養；除去舊培養基用PBS洗滌1次，加入1.5 ml TrypLETM Express酶溶液孵育1 min；加入培養液輕輕吹打使細胞分離，轉移至離心管中離心，離心完成后將細胞接種于6 cm細胞培養皿中，每個培養皿的細胞密度不超過80%。實驗檢測前24 h轉移至24孔板中培養，每孔體積為500 μl。細胞外液為145 mmol NaCl，4 mmol KCl，2 mmol CaCl2，1 mmol MgCl2，10 mmol 4-羥乙基哌嗪乙磺酸和10 mmol葡萄糖，用NaOH調節pH為7.4。細胞內溶液為140 mmol CsF，1 mmol乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸，5 mmol CsOH，10 mmol 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，10 mmol NaCl，用CsOH調節pH為7.3。用0.1%牛血清白蛋白的細胞外液稀釋3種芋螺多肽。鈉通道在全細胞膜片鉗模式下將細胞膜電位鉗制在-80 mV，從-60 mV起施加，以10 mV步幅遞增、并去極化方波刺激至+60 mV，確定能夠激發 HEK-293細胞最大鈉電流的激活電壓，再固定該刺激電壓值以50 ms、間隔時間5 s進行連續去極化方波刺激，待電流穩定后開始給藥，并同時記錄細胞膜上通道電流變化情況。

1.8 皮膚刺激性檢測 根據《化妝品安全技術規范》中的毒理學試驗方法檢測多肽對家兔皮膚的刺激性與腐蝕性，8只家兔分為四組，每組2只。試驗前24 h剪掉家兔背部脊柱兩側毛，去毛范圍為3 cm×3 cm，注意不要損傷皮膚表面；取0.5 ml 2 mmol/L的多肽溶液或純化水涂抹在家兔皮膚上，涂抹面積為2.5 cm×2.5 cm，1次/d，連續涂抹14 d[7]。第2天開始每次涂抹前應剪毛，用水或無刺激性溶劑清除殘留受試物，1 h后觀察結果，各組別相同方法處理。參考表1進行評分，每天每只動物平均積分均值=Σ紅斑和水腫積分/受試動物數/14。每只動物積分均值在0.5以下為無刺激性，每只動物積分均值0.5～2.0為輕刺激性，2.0～6.0為中刺激性，6.0～8.0為強刺激性。

1.9 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件處理本研究數據，計量資料以（x-±s）表示，行t檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01表示統計學意義顯著。

2 結果

2.1 3種異構體表征 μ-CnIIIC-Ⅰ質譜圖見圖4，峰m/z 1188.45為[M+2H]2+離子信號，峰m/z 792.63為[M+3H]3+離子信號，峰m/z 594.73為[M+4H]4+離子信號；μ-CnIIIC-Ⅱ質譜圖見圖5，峰m/z 1188.45為 [M+H]+分子離子峰；μ-CnIIIC-Ⅲ質譜圖見圖6，峰m/z 1188.37為[M+2H]2+離子信號，峰m/z 792.74為[M+3H]3+離子信號，峰m/z 594.82為[M+4H]4+離子信號，峰m/z 475.97為[M+5H]5+離子信號。

2.2 生物相容性 a組紅細胞形態見圖7a，b、c、d組紅細胞形態見圖7b、7c、7d。四組紅細胞均正常，未觀察到明顯的紅細胞溶血現象。同時，小鼠體內未發現溶血跡象。因此3種芋螺多肽均不會引起溶血現象，有良好的生物相容性。3種芋螺多肽對RAW 264.7細胞的毒性見圖8，3種芋螺多肽細胞毒性均較低。當濃度低于50 μmol/L時，μ-CnIIIC-Ⅰ對RAW 264.7細胞的相對存活率大于80%，μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ對RAW 264.7細胞的相對存活率大于75%，表明μ-CnIIIC-Ⅰ的細胞毒性低于μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ，具有很好的安全性。

2.3 μ-CnIIIC異構體對鈉通道的抑制作用 與異構體μ-CnIIIC-Ⅰ比較，μ-CnIIIC-Ⅱ異構體在NaV1.2上的活性提高，μ-CnIIIC-Ⅲ異構體的活性最高，見圖9；μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ對鈉離子通道的抑制率為23.64%、52.43%、81.21%。

2.4 皮膚刺激性研究 試驗觀察期內家兔出現非常輕的紅斑和水腫，純化水組每天每只動物積分均值為0.036，μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ組每天每只動物積分均值為0.107、0.179和0.286，雖略大于純化水組，但值均<0.5，說明3種多肽異構體對皮膚多次給藥刺激性較低，具有較高的安全性。

3 討論

芋螺多肽可以作用于離子通道，其中鈉通道廣泛分布于各種組織和器官中，參與多種生理過程，其功能的異常會導致多種疾病的發生，如疼痛、癲癇、心臟傳導病、周期性麻痹等[8]。開發針對鈉離子通道的新型化合物有助于多種疾病的治療和新型藥物的開發[9]。

本研究采用固相多肽合成法合成μ-CnIIIC 3種異構體線性肽，進一步氧化合成了μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ 3種異構體，并對其進行質譜表征，結果表明3種芋螺多肽異構體成功合成。μ-CnIIIC 3種異構體濃度在50 μmol/L范圍內時，細胞毒性實驗中細胞存活率均在75%以上，對細胞幾乎無殺傷作用；細胞溶血實驗中紅細胞完整，無溶血現象；說明3種芋螺多肽都有良好的生物安全性和較低的細胞毒性。μ-CnIIIC異構體濃度為20 μmol/L時，μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ對鈉通道的抑制率為23.64%、52.43%、81.21%，說明芋螺多肽可特異性地阻斷鈉離子通道，使鈉離子內流受阻，導致肌肉動作電位不能形成，表情肌得以放松，從而有效預防和減少皺紋，說明其可作為抗皺產品中的活性成分；另外，也表明二硫鍵的復雜程度對其功能活性有很大的影響，二硫鍵的連接次序越復雜，芋螺多肽對鈉通道的抑制作用越明顯。此外皮膚刺激性實驗每天每只動物積分均值為0.107、0.179和0.286，表明芋螺多肽的三種異構體對皮膚具有良好的安全性，可作為外用制劑發揮療效，通過涂抹即可達到注射肉毒桿菌毒素的作用，有望替代注射等侵入式祛皺方法，從而更安全有效地祛皺，避免侵入式產品對人體造成感染、面癱等潛在危害。

綜上所述，芋螺多肽活性受二硫鍵結構的影響比較確切，二硫鍵結構越復雜的芋螺多肽可更好的作為外用制劑阻斷鈉離子通道發揮抗皺等生物活性。

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編輯 劉雯