小胸鱉甲qRT-PCR 內參基因篩選和表達穩定性分析

李潔瓊

（新疆農業職業技術學院生物科技分院，新疆 昌吉 831100）

qRT-PCR 采用相對定量的方法對基因的表達量進行檢測，是分子生物學中重要的研究方法。然而，qRT-PCR 的結果不可避免地受到RNA 制備、cDNA 合成和PCR 效率等因素的影響。使用穩定性高的內參基因作為標準來校正目的基因的表達量，可減少qRT-PCR 系統的偏差［1］。理想的內參基因不受外部環境的影響，在各種組織或細胞中及各種試驗條件下都能穩定表達［2］。常用的內參基因包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Glyceral dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、18S 核糖體RNA基因（18S rRNA）、微管蛋白基因（TUBulin，TUB）、延伸因子Elongation factor 1α（EF1α）和β-肌動蛋白基因（β-actin，ACTB）［3］。部分研究直接使用未經驗證的內參基因，測得的目的基因表達水平出現了幾十甚至上百倍的偏差［1］。因尚未有針對特定試驗能穩定表達的單一通用基因，故選用內參基因進行驗證。

荒漠昆蟲小胸鱉甲（Microdera punctipennis）是中國新疆北部古爾班通古特沙漠的特有物種［4］，對干旱寒冷的極端環境表現出高度適應性，已有利用qRT-PCR 技術開展小胸鱉甲的耐寒性、氧化應激以及免疫反應等相關基因的表達分析研究，并使用編碼β-肌動蛋白的基因Mpβ-actin作為標準化的內參基因［4-7］。Mpβ-actin基因在不同溫度（-7、4、20、30、45 ℃）脅迫處理成蟲2 h 后的基因表達較穩定［4］，但不適用分析幼蟲的基因表達變化［8］，在不同組織中或者脅迫處理后的表達穩定性也有待研究［4-7］。有研究表明，2～3 個內參基因同時使用才能獲得更為精確的校正結果［1，2］。本研究選擇ACTB、GAPDH、EF1α、TUB和18S rRNA，通過對小胸鱉甲不同組織、發育階段以及在低溫處理后在不同時間取樣的成蟲個體和幼蟲個體的比較，篩選獲得最適內參基因，明確內參基因個數，為小胸鱉甲低溫應激響應的基因表達研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及處理

小胸鱉甲采集地點為古爾班通古特沙漠南部，阜康市222 團（44°24 N，087°51 E′，海拔444 m）。采集的成蟲在實驗室內沙土（于昆蟲采集地獲取）飼養，飼養條件參照獻［9］，根據發育歷期并通過測定幼蟲的體長、頭殼寬度以及體重判定幼蟲齡期［9］。篩選收集1 齡（600 只）、4 齡（210 只）、5 齡（12 只）、6齡（6 只）和7 齡（6 只）幼蟲，將不同發育階段的幼蟲4 ℃處理3 h；另取4齡幼蟲4 ℃分別處理1、3、5、7、9 h。處理后的幼蟲速凍于液氮中，轉至-80 ℃冰箱保存。

選取室內飼養的成蟲分別放置在4 ℃和-4 ℃處理0、1、3、5、7、9、11 h，處理后迅速置于液氮中。取室內飼養的3 頭成蟲為對照。

選取4 ℃處理9 h 的成蟲和未經低溫處理的成蟲（對照），用預冷PBS 沖洗3 次，用解剖針單獨解剖分離不同組織，包括前腸、中腸、后腸、脂肪體和體殼（全蟲去掉頭、腸和脂肪體后的外殼）。

1.2 提取總RNA 和反轉錄cDNA

按Trizol 試劑說明書（Invitrogen）對樣品進行總RNA 提 取，使 用TaKaRaTMRecerse Transcriptase M-MLV 進行反轉錄合成總cDNA，于-20 ℃低溫保存。

1.3 引物設計

基于小胸鱉甲的轉錄組測序結果［7］，選取5 種內參基因ACTB、GAPDH、EF1α、TUB和18S rRNA的cDNA 序列。用DNAMAN 7 軟件設計引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 5 個內參基因用于qRT-PCR 擴增的引物序列及擴增效率

1.4 構建標準質粒

以小胸鱉甲的cDNA 為模板，PCR 擴增5 個基因相應的目的片段，并連接到pMD18-T 載體上，作為qRT-PCR 的標準質粒。將測序正確的標準質粒作為原液，稀釋到不同的濃度梯度（1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7ng∕μL）作為qRT-PCR 的模板，進行qRT-PCR 反應，繪制標準曲線，計算引物擴增效率。

1.5 候選內參基因的qRT-PCR

qRT-PCR 反應使用ABI 7500 型定量PCR 儀，按照Platinum SYBR GREEN qPCR SuperMix-UDG（Invitrogen，USA）說明書操作。反應體系25.0 μL，包含1.0 μL cDNA，正反向引物各1 μL（終濃度各為0.5 μmol∕L），12.5 μL Platinum SYBR Green real-time PCR SuperMix-UDG with ROX 和9.5 μL RNase-free H2O；反應條件為50 ℃2 min；95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，45 個循環。陰性對照取1.0 μL RNase-free H2O 為模板進行擴增。每個cDNA 樣本設置2 個技術重復。記錄每個反應管中熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環次數（Ct）。

1.6 數據處理與分析

將qRT-PCR 所得到的5 個基因的Ct通過2-ΔΔCt方法轉化為相對定量數據。利用geNorm［10］、Norm-Finder［11］、BestKeeper［12］、ΔCt［13］和RefFinder（http：∕∕www.leonxie.com∕referencegene.php）分析5 個基因的表達穩定性并排序。

2 結果與分析

2.1 內參基因引物特異性及擴增效率評估

設計引物并擴增5 個目的基因片段（表1），構建重組質粒作為標準品進行qRT-PCR 反應得到溶解曲線（圖1），電泳檢測5 個基因的qRT-PCR 擴增產物（圖1）。結果表明，5 個基因的溶解曲線無雜峰，擴增產物單一，擴增效率接近100% ，標準曲線的判定系數＞0.99，表明定量引物設計合理，可用于對5個基因的定量檢測。

圖1 5 個內參基因的溶解曲線與擴增產物

2.2 內參基因的表達豐度和變異分析

檢測5 個內參基因在小胸鱉甲39 份樣品（5 個發育歷期、5 種組織、不同低溫處理的成蟲及幼蟲）中的Ct，結果表明5 個基因表達豐度較高，存在一定的差異（圖2）。根據Ct的變化，18S rRNA在不同樣品間的表達差異最小，其次是EF1α、GAPDH和ACTB，TUB的Ct波動最大。

圖2 5 個內參基因的Ct 變化區間

2.3 不同發育歷期內參基因的表達穩定性

使 用geNorm、NormFinder、BestKeeper、△Ct和RefFinder 評估5 個內參基因的表達穩定性（表2）。在不同發育歷期樣品中，根據NormFinder，△Ct和RefFinder分析，基因的穩定性排序為EF1α＞GAPDH＞ACTB＞18s rRNA＞TUB。而BestKeeper 分析表明18s rRNA和TUB基因不適合選用（SD＞1）。根據Ge-Norm 軟件提供的成對變異值（Vn∕Vn+1）確定內參基因的最佳數目，在不同發育歷期中所有成對變異值均高于0.15（圖3），表明可選擇多個基因共同作為內參基因使用。小胸鱉甲不同發育歷期中最優內參基因組合為EF1α、GAPDH和ACTB（表2）。

2.4 不同組織中內參基因的表達穩定性

在小胸鱉甲不同組織樣品中，RefFinder、Norm-Finder 和ΔCt方法分析得到相同的穩定性排序為EF1α、ACTB、18S rRNA、TUB和GAPDH（表2）。盡管RefFinder 的GM顯示所有基因都合適（GM＜5），但BestKeeper 分析顯示GAPDH、ACTB和TUB不適合選為參考基因（標準偏差SD＞1）。GeNorm 分析顯示Vn∕Vn+1均高于0.15（圖3），表明不同組織樣品中最優內參基因組合為EF1和18S rRNA。

2.5 不同溫度處理的基因表達穩定性

比較5 個內參基因低溫（-4 、4 ℃）脅迫不同時間的穩定性，包括成蟲分別4 ℃和-4 ℃處理0、1、3、5、7、9 、11 h 的RNA 樣品，與4 齡幼蟲在4 ℃下處理1 、3、5、7 、9 h 的RNA 樣品。RefFinder、NormFinder 和ΔCt方法分析得到相同的穩定性排序為EF1α、ACTB、TUB、18S rRNA和GAPDH（表2）。GeNorm 分析顯示V2∕V3低于0.15（圖3），表明只需選擇EF1a和ACTB作為不同溫度處理條件下的最優內參基因組合。

圖3 geNorm 分析不同試驗條件下最優內參基因數目

表2 不同評估方法基因的穩定性排序與最優內參基因組合

2.6 所有供試樣品中內參基因的表達穩定性

為篩選通用內參基因，將所有供試樣品（共39份樣品：5 個發育歷期、5 種不同組織及不同低溫處理的成蟲和幼蟲）的qRT-PCR 原始數據放在一起進行評估（表2），最穩定的是EF1，其他4 個基因的穩定性排序表現出較大的變化。根據GeNorm 分析，Vn∕Vn+1均高于0.15（圖3）。綜上分析小胸鱉甲所有樣品最優內參基因組合為EF1、ACTB和TUB（表2）。

3 小結與討論

看家基因表達的穩定性評價要求用嚴格的數學方法去計算［12］。由于每種統計方法具有獨立的計算方法和適當的應用條件，在本研究中，每種算法都對5 個基因給出了不同的排名，ΔCt和NormFinder 分析得到的結果在所有條件中都相似。其中，EF1α基因在不同條件下基于5 種方法在獨立或綜合排名中都是第一位，表明EF1α基因在5 個候選基因中穩定性最佳，可作為可靠的內參基因應用于小胸鱉甲的遺傳分子學研究。類似的，延伸因子EF1α也是瓢蟲和二化螟的不同發育時期、組織樣品和溫度處理樣品較佳的參考基因［3，14］。研究也表明，溫度處理小菜蛾［15］和蓮草直胸跳甲不同發育階段［16］中EF1a基因不穩定。內參基因的穩定性因昆蟲組織、發育階段、物種和各種非生物脅迫條件的不同而不同［1］，因此，在qRT-PCR 之前應驗證內參基因的穩定性［16］。

肌動蛋白Actin 是飛蝗的前腸［17］以及不同濃度微孢子感染后［18］穩定的內參基因之一，本研究經BestKeeper 分析發現ACTB不適合在研究小胸鱉甲不同組織中做內參，但ACTB與EF1a、GAPDH共同使用卻是研究小胸鱉甲不同發育歷期的上佳組合。TUB和GAPDH基因也是如此，在小胸鱉甲不同組織和發育階段中TUB和GAPDH基因表達穩定性排名變化較大，但二者分別與EF1a組成了最優內參基因組合，適用于不同發育歷期和溫度處理的樣品。不同溫度處理美國白蛾，較穩定的內參基因組合是EF1A和GAPDH［19］。不同微孢子蟲濃度感染東亞飛蝗的最適內參基因組合為ACT、EF1和TUB［18］，與本研究的結論相似。建議使用昆蟲ACTB、TUB和GAPDH作內參時，與其他參考基因共同使用，有利于qRT-PCR 試驗獲得準確、可靠的結果。

有研究用18S rRNA作為內參基因［20］。rRNA 用于qPCR 內參基因已被質疑，因為rRNA 并不能代表全部的mRNA［21］，且細胞內rRNA 表達豐度遠高于目標mRNA 的豐度，使準確降低。本研究綜合分析了18S rRNA的穩定性，與其他4 個基因比，18S rRNA穩定性較差。參考嗜卷書虱的18S rRNA基因［22］，不建議小胸鱉甲基因表達研究中使用18S rRNA作內參基因。

內參基因的選擇，對于基因表達的準確定量、應激響應的差異表達倍數的確定至關重要，特別在新發現的功能基因表達研究中，更要謹慎。本研究通過多重比較，篩選出小胸鱉甲不同發育歷期、不同組織、低溫處理條件下較佳內參基因組合，為小胸鱉甲功能基因驗證及相對表達量研究奠定了基礎。