等溫?cái)U(kuò)增熒光法快速鑒定羊肉摻假

段真文，許紹坤，張 薇，李鮮鮮，董文玥

（云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650000）

隨著肉類價(jià)格差異逐步拉大，以次充好的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，這種行為不僅損害消費(fèi)者的權(quán)益和健康，還會(huì)擾亂市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)[1]。加強(qiáng)肉類食品的監(jiān)督管理，除了制定一系列政策、法規(guī)制度外[2]，還需要可靠的檢測(cè)方法。現(xiàn)階段羊肉摻假鑒定的方法有很多，主要有傳統(tǒng)感官鑒別方法和常規(guī)PCR 方法[3]。傳統(tǒng)感官鑒別方法是人們根據(jù)生活經(jīng)驗(yàn)對(duì)肉類食品性狀進(jìn)行鑒別。因肉制品中蛋白質(zhì)的干擾因素多變性、DNA的高溫穩(wěn)定性和高度守恒，常規(guī)PCR 檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用范圍也更廣[4]。但是常規(guī)PCR 檢測(cè)方法需要專業(yè)的檢測(cè)人員，對(duì)儀器設(shè)備的要求高，整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的移動(dòng)性差，成本高，難以滿足食品新鮮度現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)的要求。

等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)方法是核酸體外快速擴(kuò)增與熒光檢測(cè)方法融合的新型核酸診斷POCT 方法，針對(duì)目的片段多個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 ～6 條特異引物，通過(guò)添加熒光染料實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，可以兼容實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。與普通PCR 技術(shù)相比優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)操作、縮短了檢測(cè)時(shí)間。本研究建立的快速鑒定羊肉摻假的等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)方法解決了傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法無(wú)法現(xiàn)場(chǎng)化、快速化鑒定羊肉摻假的問(wèn)題，為羊肉摻假鑒定提供了一種快速準(zhǔn)確的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮羊肉來(lái)自超市購(gòu)買(mǎi)的樣本、Isothermal Mastermix、氫氧化鉀。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀、移液器、恒溫金屬浴、旋渦振蕩儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、DT-PRIME 和超微量紫外分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取

（1）樣本預(yù)處理。用一次性手術(shù)刀片在肉內(nèi)部取樣（約3 mm×3 mm），將樣本放置在一次性培養(yǎng)皿中，再用刀片將樣本切碎，便于提取DNA。

（2）樣本提取DNA。將處理好的羊肉樣本放入裝有1 mL 0.3 mol·L-1KOH 溶液的離心管中，手動(dòng)搖勻使樣本完全浸沒(méi)在溶液中后，再放入95 的恒溫金屬浴中加熱10 min，加熱結(jié)束后冷卻靜置至室溫5 min，即得到樣本的DNA，取200 μL 上清液保存?zhèn)溆?，DNA 濃度為554 ng·μL-1。

1.3.2 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化

（1）等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)方法的初建立。通過(guò)查詢資料，初步確定反應(yīng)體系為Isothermal Mastermix 15 μL；FIP、BIP、F3、B3、LF 和LB 各1 μL；樣本1 μL；加3 μL 水補(bǔ)齊至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ，50 min；熔解程序?yàn)?8 ～80 ，0.05 ·s-1；通過(guò)分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（2）引物組設(shè)計(jì)。針對(duì)羊的線粒體序列保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)2 套引物組，使用GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載全序列，使用BLAST 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并通過(guò)Lamp Designer 引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 LAMP 特異性引物序列

（3）引物篩選。取適量樣本，對(duì)羊的兩套引物組進(jìn)行篩選，通過(guò)特異性、靈敏度實(shí)驗(yàn)篩選出引物效率高且擴(kuò)增穩(wěn)定的引物組，最優(yōu)引物組是SP-1。

（4）引物組工作濃度配比的優(yōu)化。將羊引物組的F3、B3 稀 釋 成5 pmol；FIP、BIP 分 別 稀 釋 成40 pmol、10 pmol、5 pmol；LF、LB 分別稀釋成50 pmol、20 pmol、5 pmol。F3、B3 和FIP、BIP 和FIP、BIP 各取等量按照1 ∶8 ∶4、1 ∶2 ∶1、1 ∶5 ∶10 的比例進(jìn)行混合。按照反應(yīng)體系，使用3 組不同引物組工作濃度配比進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ，30 min。

（5）反應(yīng)條件優(yōu)化。確定最佳引物組工作濃度配比后，按照反應(yīng)體系對(duì)羊肉樣本進(jìn)行反應(yīng)溫度的探索試驗(yàn)，根據(jù)反應(yīng)溫度梯度設(shè)置的原則，設(shè)置8 個(gè)溫度梯度，反應(yīng)溫度以64.5 為中間溫度，反應(yīng)溫度為61 ～68 ，擴(kuò)增時(shí)間為30 min；熔解程序?yàn)?8 ～80 ，0.05 ·s-1；通過(guò)分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（6）特異性實(shí)驗(yàn)。按照優(yōu)化后的引物配比和反應(yīng)溫度，使用羊肉的引物對(duì)雞、豬、牛、羊提取的核酸樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。

（7）靈敏度試驗(yàn)。將羊肉核酸樣本用ddH2O 按照10 倍倍比進(jìn)行稀釋至10-10，設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照，檢測(cè)最低檢測(cè)限。

2 結(jié)果與分析

2.1 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)方法的初建立

對(duì)查閱到的初步確定體系進(jìn)行驗(yàn)證，羊肉出峰時(shí)間為11.83 min，熔解溫度為84.83 ，確定反應(yīng)體系25 μL 總 體 系Isothermal Mastermix 15 μL；FIP、BIP、F3、B3、LF 和LB 各1 μL；樣本1 μL；加3 μL水補(bǔ)齊至25 μL。

2.2 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)方法的優(yōu)化

2.2.1 引物組工作濃度配比的優(yōu)化

將第1 孔中加入陰性對(duì)照，第2—4 孔中加入羊的DNA 樣本。其中第2、3、4 孔中引物組配比分別為1 ∶8 ∶4、1 ∶2 ∶1、1 ∶1 ∶10。結(jié)合擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析，羊最佳引物組工作濃度配比為1 ∶8 ∶4，該配比條件下出峰最快，有特定的熔解溫度，其余引物組配比在30 min 內(nèi)沒(méi)有出峰，對(duì)樣本的擴(kuò)增效率不太理想。

2.2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

對(duì)羊肉DNA 樣本進(jìn)行反應(yīng)溫度的摸索試驗(yàn)，設(shè)置8 個(gè)溫度梯度，反應(yīng)溫度以64.5 為中間溫度，羊的DNA 樣本在65 時(shí)擴(kuò)增最快，擴(kuò)增時(shí)間為12.23 min，溶解溫度為84.52 。其余反應(yīng)溫度的擴(kuò)增效果均沒(méi)有65 時(shí)好。

2.2.3 特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

檢測(cè)羊肉中是否含有其他肉類成分，1—4 號(hào)孔中分別加入羊肉的特異性引物，加入雞、豬、牛、羊肉DNA 樣本進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出只有第一個(gè)孔出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)“S”型的擴(kuò)增曲線并有特異的熔解溫度，即在羊肉樣本中只檢測(cè)出羊肉成分，未檢出其他肉類成分。

圖1 擴(kuò)增曲線

圖2 熔解曲線

2.2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

最低檢出限為5.54×10-5ng·μL-1，樣本濃度達(dá)到該濃度均起峰，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果；若樣本濃度低于此濃度，則不會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，可能是因?yàn)闃颖玖坎蛔悖瑹晒庵颠^(guò)低檢測(cè)不到擴(kuò)增過(guò)程。

3 討論

3.1 引物組工作濃度配比及反應(yīng)溫度的優(yōu)化

反應(yīng)溫度和引物組工作濃度配比會(huì)影響等溫?cái)U(kuò)增熒光法的擴(kuò)增效果。引物濃度過(guò)低，可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的熒光值過(guò)低儀器難以監(jiān)測(cè)，降低產(chǎn)率；引物濃度過(guò)高，可能會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，增加引物二聚體的風(fēng)險(xiǎn)。在合適的范圍內(nèi)，改變引物濃度配比可以增加反應(yīng)的擴(kuò)增效率和穩(wěn)定性[5]，提高反應(yīng)的靈敏度。

3.2 引物特異性和靈敏度

本研究針對(duì)羊線粒體的Cytb 基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的特異性。羊的特異性引物只擴(kuò)增該樣本，對(duì)提取的樣本DNA 進(jìn)行稀釋可檢測(cè)到稀釋倍數(shù)的7 倍。選取的樣本只是該肉類種屬的新鮮樣本，未摻入其他肉類，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

4 結(jié)論

本研究采用直擴(kuò)法簡(jiǎn)化樣本處理步驟，以等溫?cái)U(kuò)增熒光法快速鑒定羊肉種屬和摻假，結(jié)果準(zhǔn)確可靠且具有良好的特異性和靈敏度。該方法使樣本的檢測(cè)更加快速，可在30 min 內(nèi)檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求，實(shí)現(xiàn)肉制品現(xiàn)場(chǎng)化檢驗(yàn)，為肉制品種屬鑒定提供新的方法。