廈門水產品中河弧菌的調查分析

翁琴云

（廈門市食品藥品質量檢驗研究院，福建廈門 361012）

河弧菌是一種嗜鹽的革蘭氏陰性細菌，廣泛分布于海水、河水環境以及海洋動物的體內，不僅對水產品產生嚴重的危害，還會引起人類急性腸胃炎以及腸道外感染[1-2]，在全球范圍內引起腹瀉的散發與暴發流行事件中，河弧菌在致病性弧菌中的檢出率僅次于霍亂弧菌和副溶血性弧菌，而且河弧菌介導的感染經常發生在大量消費水產品的地區，是一種具有流行潛力的食源性病原菌[3-4]。我國食源性疾病暴發系統監測資料顯示，河弧菌已導致一部分食源性疾病的發生[5-6]。廈門地處沿海，人們日常的飲食離不開水產品，而且隨著經濟發展，人均水產品消費呈現快速上升勢頭。因此，加強水產品中河弧菌監測并研究其毒力基因的分布及耐藥情況對食源性疾病事件的預防以及控制具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

從廈門市零售店、超市、農貿市場等場所采集了210 份水產品，包括淡水魚、海水魚以及貝類水產品。

1.1.2 試劑

3%堿性蛋白胨水、TCBS 瓊脂、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂（北京陸橋生物科技有限公司）；弧菌顯色培養基（法國科瑪嘉公司）；API 20E 試劑盒（法國梅里埃公司）；河弧菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）（深圳生科原生物有限公司）；革蘭氏陰性細菌藥敏卡AST-GN09（法國梅里埃公司）；常規PCR 以及電泳相關試劑（上海生工生物工程有限公司）。

1.1.3 引物

參考已有文獻[7-8]，委托上海生工生物有限公司合成河弧菌毒力相關基因vfh、hupO、vfp和toxR的擴增引物，引物序列見表1。

表1 河弧菌毒力基因PCR 檢測的引物序列

1.2 儀器

GNP-9160 隔水式恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；CFX96 Touch 實時熒光PCR 儀（美國伯樂公司）、Powerpac 瓊脂糖電泳儀（美國伯樂公司）、Gel doc XR 凝膠成像儀（美國伯樂公司）；VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統（法國梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 河弧菌的檢測

河弧菌的檢測主要依據美國食品和藥品管理局發布的細菌分析學手冊（BAM）第九章弧菌的方法進行檢測，并在增菌環節以及鑒定環節增加河弧菌熒光PCR 方法檢測。

1.3.2 制備DNA 模板

用菌環挑取單菌落于500 μL 無菌去離子水，99 裂解5 min，12 000 r·min-1離心2 min（離心半徑為5 cm）后取上清。

1.3.3 藥敏試驗

按照革蘭氏陰性細菌藥敏卡AST-GN09 試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 數據分析應用SPSS 23 對數據進行分析，弧菌檢出率組間差異用χ2檢驗，p＜0.05 差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 水產品中河弧菌的檢測結果分析

由表2 可知，210 份水產品中，有57 份檢出河弧菌，共分離得到57 株分離株（一份樣品只保存一株），河弧菌總檢出率為27.14%。其中，貝類水產品檢出率最高，經過比較，只有貝類水產品與淡水魚存在顯著性差異（χ2=5.59，p＜0.05），貝類與海水魚，海水魚與淡水魚不存在顯著性差異。

表2 水產品中河弧菌檢測結果

2.2 毒力基因分析

由圖1 知，57 株河弧菌均攜帶vfh和toxR基因，其中有44 株攜帶vfp基因（77.19%）；46 株攜帶hupO基因（80.70%）。分析各毒力基因的分布情況：同時攜帶4 種基因（毒力基因類型為vfh+hupO+vfp+toxR+）的河弧菌居多（71.93%），vfh+vfp+hupO-toxR+基因型最少，只有3 株（5.26%）。7 株從淡水魚中分離得到的菌株全部都是vfh+vfp+hupO+toxR+型，其他類別的水產品中分離株在4 個型別中有不同程度的分布，詳見圖1。

圖1 河弧菌在不同類水產品中的基因分布情況

2.3 耐藥性分析

由表3 可知，相對于其他抗生素，河弧菌對臨床上常用的抗生素氨芐西林、頭孢唑林以及復方新諾明呈現較突出的耐藥性，耐藥率分別是12.28%、10.53%以及8.77%；對于哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛以及頭孢呋辛酯分別有不同程度的耐藥，對于其余14 種抗生素均為敏感；進一步研究表明，對2 類及3 類抗生素呈現耐藥性的有12 株（21.05%），其中有1 株來源于油蛤的菌株（毒力基因類型為vfh+hupO+vfp+toxR+同時對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、復方新諾明等3 類抗生素耐藥）。

表3 57 株河弧菌耐藥情況

3 結論與討論

廈門市水產品中河弧菌檢出率為27.14%，總體上高于其他地區[9-11]的檢測結果。這除了與樣品類別、采樣時間、采樣區域等因素有關外，還與檢測方法相關。本研究在常規培養的基礎上，樣品經增菌液增菌后先運用熒光PCR對增菌液進行快速篩查，PCR 結果為陽性的增菌液接種于TCBS 以及弧菌顯色培養基，經培養后再挑取可疑菌落進行鑒定，PCR結果為陰性的樣品則直接判定為未檢出河弧菌。在檢測步驟中加入PCR 方法有助于對平板劃線結果的準確判斷，有助于提高檢測效率。另外，本研究的結果顯示淡水魚中存在著一定程度的河弧菌污染（檢出率為14.58%），而且與海水魚的檢測率不存在顯著性差異，分析原因，可能是淡水養殖水體存在污染[12]，也可能是因為農貿市場、超市等部分銷售場所環境復雜，儲藏條件不當，比如存在海水魚、淡水魚混養的現象等都有可能造成交叉污染。

河弧菌可以產生類腸毒素物質、細胞毒素、金屬蛋白酶和溶血素等多種與致病相關的毒力因子，目前從河弧菌中分離得到的主要毒力基因包括溶血素（vfh）、亞鐵血紅素利用蛋白（hupO）、金屬蛋白酶（vfp）和毒力基因調控蛋白（toxR），它們在致病過程中發揮著不同的作用，與河弧菌致病性緊密相關。本研究從水產品中分離得到的57 株河弧菌均攜帶vfh和toxR基因，vfp、hupO基因攜帶率分別為77.19%以及80.70%。與本研究結果相似，張晶等[11]在從水產品分離得到15 株河弧菌vfh和toxR基因的攜帶率均為100.0%，hupO以及vfp基因的攜帶率分別為60.0%及80.0%；周妍妍等[13]報道臨床分離的9 株河流弧菌均攜帶vfh和toxR基因，而hupO的攜帶率為77.8%，vfp的攜帶率為44.44%。這4 種毒力基因廣泛分布于河弧菌臨床以及水產品分離株中。

近年來，隨著抗生素的廣泛使用，河弧菌的耐藥性問題也越來越嚴重，尤其是多重耐藥菌株的出現令人十分擔憂。LIANG 等[7]報道44 株來源于海產品以及臨床河弧菌分離株對氨芐西林、阿奇霉素、磺胺甲基異惡唑和阿莫西林/棒酸的耐藥情況比較突出，27.3%的菌株表現出多耐藥性。本研究從水產品中分離得到的河弧菌分離株有20 株（35.09%）對抗生素產生不同程度的耐藥，對氨芐西林、頭孢唑林以及復方新諾明的耐藥率分別達到12.28%、10.53%以及8.77%。水產品中的河弧菌呈現不同程度的耐藥性，給水產品以及人類健康帶來了潛在的安全隱患。

綜上所述，在廈門市水產品中河弧菌存在較高程度的污染以及多種毒力基因的檢出、耐藥菌株的存在，提示河弧菌給廈門市水產品帶來一定的食品安全風險，對消費者的健康構成潛在威脅，應當引起相關部門的重視，未來需加強對水產品中河弧菌的監測。但目前關于河弧菌的檢測，尚未有河弧菌的國家標準方法可以參考，后續研究中，可以通過優化增菌、選擇性培養基條件等來提高河弧菌的檢測效率，從而為加強河弧菌連續監測提供技術支持。另外，在本研究的基礎上可以深入開展更多關于河弧菌的研究，比如篩選更多的毒力基因，研究毒力基因的表達，篩選耐藥基因、探索河弧菌的耐藥性與致病機制之間的關系等，為河弧菌的監測及防控提供科學依據。