天然水凝膠在組織再生工程中的研究進展

黎 婷

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學院，安徽 蕪湖 241000）

組織工程學基于生物學和工程學原理，利用支架、細胞和刺激物誘導(dǎo)新組織的生成，使用功能性生物制品重建或改善組織功能[1].相對于合成材料，天然來源支架的微分子結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)和生物功能的優(yōu)勢，可顯著促進細胞生長和細胞分化，在組織工程和再生醫(yī)學中效果更好[2].天然來源支架微結(jié)構(gòu)類似于組織的細胞外基質(zhì)，因其保留了蛋白質(zhì)和多肽-氨基酸鏈（如膠原蛋白和彈性蛋白）、多糖-糖鏈（如甲殼素、纖維素和肽聚糖）、核苷酸鏈（如DNA 和RNA），展現(xiàn)出高生物相容性、含有細胞結(jié)合位點、適合細胞黏附，其來源包括植物、動物（異種）和人[3].

基于交聯(lián)機制制備的水凝膠形成的三維空間含水量豐富，具有天然組織細胞外基質(zhì)的物理化學特性和生物特性，后期易于使用化學方法和生物方法（如刺激分子和生長因子）進行修飾，可增強其生物功能性[4].由于水凝膠提供的細胞生長環(huán)境優(yōu)勢，細胞易于黏附、生長、分化、形成組織樣結(jié)構(gòu)[5].近年來，為滿足特殊組織需求，組織工程學制備了多種新型水凝膠.

本文中，筆者主要介紹通過多種交聯(lián)機制產(chǎn)生的水凝膠及其作為聚合物的應(yīng)用以及未來超分子化學和納米技術(shù)的應(yīng)用前景[6].

1 水凝膠交聯(lián)機制

水凝膠通過物理和化學不同機制基于水環(huán)境中進行分子鏈交聯(lián)，物理膠凝作用包括熱離子膠凝、自聚、離子和靜電交互，但是這些方法制備的水凝膠化學特性依賴于聚合物的固有特性，化學交聯(lián)方法制備的水凝膠更易于被修飾，從而表現(xiàn)出良好的生物功能性[7].

在凝膠過程中，隨著溫度的變化，聚合鏈發(fā)生牽連，溫度的增減會改變凝固物的溶解性，甚至會造成聚合物的凝固.物理膠凝交聯(lián)機制和轉(zhuǎn)變溫度取決于聚合物的材質(zhì)和分子量，例如明膠，哺乳動物凝膠的膠凝溫度較高（25℃），淡水魚凝膠的膠凝溫度較低（10～12℃）[8].自聚取決于聚合物（范德華力、氫鍵和疏水鍵）中弱的共價鍵，如膠原自聚取決于分子中的脯氨酸和羥脯氨酸，易于形成膠原蛋白[9].離子和靜電交互作用機制為相反電荷的相互作用，例如海藻鹽膠凝機制為離子交聯(lián)，由于聚合物凝固過程羧化物中二價陽離子如Ca2+的螯合作用[7].

聚合物通過共價交聯(lián)形成的水凝膠具備化學活性基團，例如酶解生物化學等方法，使得水凝膠更加穩(wěn)定，并且更具靈活性，在水凝膠形成過程中更易控制[7]，且沒有細胞毒性影響，如過氧化物酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、酪氨酸酶等其他酶，故而近年來酶解交聯(lián)制備的水凝膠由于良好的生物相容性和無致免疫性，被廣泛應(yīng)用于組織再生工程[10].

2 水凝膠與細胞外基質(zhì)

天然組織的去細胞外基質(zhì)具有組織結(jié)構(gòu)的完整性，可提供種子細胞附著和定位的黏附底物，并為種子細胞生存和分化提供足夠的生物化學刺激因子.大部分去細胞外基質(zhì)形成的水凝膠樣結(jié)構(gòu)，是基于粘多糖和蛋白多糖中多種纖維蛋白形成的結(jié)構(gòu)[8].去細胞外基質(zhì)的組成具有組織/器官特異性，與組織功能有直接關(guān)聯(lián)，例如骨作為支撐組織，礦物質(zhì)豐富，肌腱彈性纖維豐富，張力大.因此，組織特異性的去細胞外基質(zhì)可誘導(dǎo)祖細胞/干細胞進行特異性分化，組織細胞外基質(zhì)制備的水凝膠具備天然組織的生物物理學和生物化學特性[11].

2.1 蛋白質(zhì)

通過細胞外基質(zhì)或重組膠原、層粘連蛋白、纖維蛋白、纖連蛋白及彈性蛋白制備的蛋白質(zhì)，被用于制作組織再生工程中應(yīng)用的仿生水凝膠和支架.大部分組織和器官干重的90%是膠原，因此，膠原是哺乳動物細胞外基質(zhì)在生物材料中的應(yīng)用被研究最多的蛋白.膠原在自然界動物體內(nèi)分布最為廣泛，膠原制備的水凝膠生物相容性，生物降解能力和細胞識別性能高，缺點是機械性能和穩(wěn)定性較低，機械性能可通過化學交聯(lián)（如戊二醛、甲醛和碳化二亞胺）和物理交聯(lián)（如凍干或加熱干燥）增強[12].

明膠是通過水解膠原制備的，便于通過不同方法和化學試劑進行修飾，例如使用甲基丙烯酰基修飾后的明膠制備的水凝膠目前被用于生物打印、光刻、微成型、自聚和微流控技術(shù)，其他方法修飾的水凝膠被用于臨床治療中再生各種組織.制備血管注射型和共價交聯(lián)型明膠水凝膠，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶通過酶促反應(yīng)制備的水凝膠穩(wěn)定性優(yōu)越，應(yīng)用于多種生物醫(yī)學工程[13].

彈性蛋白是一種具有高度彈性的細胞外基質(zhì)蛋白，賦予組織可復(fù)原的收縮性，由于其溶解性差，技術(shù)改良性有限，所以在組織工程應(yīng)用領(lǐng)域使用較少.但是彈性蛋白原具有可溶性，物理化學特性與彈性蛋白相似，且易于修飾，并具有類似生長因子促有絲分裂的特性，可促進干細胞歸巢和分化[14].重組和合成的彈性蛋白類似多肽顯示出較好的擴展性和熱屬性，可用于制備生物材料，包括納米粒子、靜電紡絲超細纖維和水凝膠交聯(lián)體[15].

多種聚合物可功能化賦予細胞結(jié)合蛋白功能域以制備具有生物活性的水凝膠.精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺三肽是各種細胞外基質(zhì)蛋白中最小的結(jié)合功能域，可賦予聚合物細胞黏附、遷移和通路激活的功能，例如纖連蛋白序列中的精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺三肽可促進結(jié)合粘附性，調(diào)控生長因子信號通路，但是相對于天然蛋白結(jié)構(gòu)，人工賦予的結(jié)合功能域，細胞黏附的緊密性和特異性較差.特異性重組纖連蛋白片段修飾的透明質(zhì)酸和水凝膠，可增強調(diào)控細胞功能精確性，增強組織再生[16].

2.2 多糖

粘多糖是細胞外基質(zhì)中最多的多糖種類，可與蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白聚糖，天然細胞外基質(zhì)中的多糖對于維持組織結(jié)構(gòu)和調(diào)控細胞生長和分化通路起到了關(guān)鍵作用.粘多糖可分為無硫酸（透明質(zhì)酸）和硫酸（類肝素、肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素和硫酸角質(zhì)素），其多種細胞和生物功能被用作生物材料應(yīng)用于組織再生工程[17].

骨和軟骨中富含的硫酸軟骨素是一種可生物降解的硫酸粘多糖，富含乙酰半乳糖胺和葡糖醛序列，負電荷密度高，生物醫(yī)學中使用的硫酸軟骨素多取自于牛和鯊魚的氣管[18].硫酸軟骨素分子量小，具有陰離子特性，常用于中和陽離子聚合物（如纖維、細胞膜和納米粒子），經(jīng)過化學修飾后制備水凝膠，用于體內(nèi)和體外對軟骨疾病進行組織修復(fù)[19].

透明質(zhì)酸是唯一一種硫酸粘多糖，由葡糖醛和乙酰氨基葡萄糖組成的二糖重復(fù)排列組成，是哺乳動物細胞外基質(zhì)中重要的組成成分，從動物分離的透明質(zhì)酸用于生物技術(shù)和生物醫(yī)學工程，近年來生產(chǎn)中主要通過微生物發(fā)酵以制備透明質(zhì)酸.透明質(zhì)酸主要通過化學方法修飾其制備的水凝膠，用于3D 生物打印制造生物支架，可保持種子細胞的分化能力，促進軟骨標志基因的表達和粘多糖沉積[20].

2.3 去細胞組織和器官

使用去細胞技術(shù)制備生物支架對全器官組織工程和體外器官模型發(fā)展具有推動作用，去細胞器官可保持完整的天然器官結(jié)構(gòu)，再植入干細胞或祖細胞，其特殊的生物反應(yīng)器特性可模擬該器官的特殊生理特性[21].全器官組織工程中在臨床移植的應(yīng)用需要突破去細胞和再細胞化的過程因素、內(nèi)皮組織形成和組織特異性生物反應(yīng)器的局限[22].

去細胞組織的細胞外基質(zhì)通過酶促溶解、調(diào)節(jié)至生理pH 值和溫度后，可被制備成生物反應(yīng)器水凝膠，這樣的水凝膠來源豐富，具有組織特異的生物反應(yīng)器性能、結(jié)構(gòu)和彈性，并具有生物相容性.一些去細胞組織的細胞外基質(zhì)由于其組織物理化學和生物特性，制備的水凝膠已經(jīng)用于動物移植實驗體外器官/組織重構(gòu)，展現(xiàn)出未來用于臨床治療的前景[23].

盡管如此，通過人體器官捐獻或動物來源制備的去細胞組織細胞外基質(zhì)，其免疫反應(yīng)、不可控因素和組織/器官來源數(shù)量的有限性，成為其臨床應(yīng)用需要克服的局限性，目前去細胞組織細胞外基質(zhì)遠遠達不到臨床移植的標準[23].

3 水凝膠與組織工程應(yīng)用

組織工程中應(yīng)用的水凝膠制備方法和生化特性日益更新，可賦予水凝膠更可控的物理化學特性，如強度更高、空間結(jié)構(gòu)越準確以及更好的特質(zhì)（如對溫度、pH、磁場、電場或者其它刺激因子的應(yīng)答性），從而創(chuàng)造更為精確的細胞微環(huán)境[24].靜電交聯(lián)方法制備的水凝膠沒有細胞外基質(zhì)的高活力性，這樣的水凝膠沒有抗壓性能，植入種子細胞后的傳播性、遷移性和增殖性差，需要通過水解或酶解才可能降解，但是一些其它方法制備的水凝膠缺點為機械性能差，如降解快、結(jié)構(gòu)均質(zhì)性低，因此需要進一步研究控制細胞對生物物理因子的回答性能[25].

水凝膠的活性表現(xiàn)在受體和聚合物水凝膠的主客體反應(yīng)，受體大循環(huán)中的分子循環(huán)，如環(huán)糊精等，對受體疏水分子的親和力高，因此被經(jīng)常用于生物醫(yī)學，天然（如透明質(zhì)酸）與合成聚合物（如聚丙烯酰胺和聚乙烯乙二醇）制備的可逆超分子水凝膠與受體互補性也高[26].動態(tài)交聯(lián)制備的可注射水凝膠可以直接進行細胞封裝，例如改良的透明質(zhì)酸水凝膠切力變稀后，可進行注射，注射位點保留度高，在小鼠心肌梗塞模型的表現(xiàn)出一定的治療效果，但是透明質(zhì)酸水凝膠穩(wěn)定性和機械性能低，可通過超分子水凝膠交聯(lián)法改進[20].例如通過己二胺結(jié)合透明質(zhì)酸改良的水凝膠可進行注射，細胞相容性增強，促進人骨髓間充質(zhì)干細胞的軟骨發(fā)生[20].這些水凝膠性能改良研究的主要目的是增強水凝膠與受體之間的互作性能，支持生物工程改造骨髓間充質(zhì)干細胞的長期存活和轉(zhuǎn)基因表達，未來可應(yīng)用于癌癥等其它疾病的細胞治療[27].

在組織缺陷活體動物模型中，具有生物相容性的可注射水凝膠可進行細胞移植，增強干細胞介導(dǎo)的血管生成和骨生成[27]，進一步驗證了水凝膠在組織工程應(yīng)用的前景.

4 結(jié) 論

組織工程掀起了人工合成功能性組織和器官替代物的新潮，近10 年來，從細胞生物學到生物材料合成，以及加工技術(shù)取得了巨大的成果.生物制造業(yè)隨之產(chǎn)生，并伴隨組織工程不斷發(fā)展，產(chǎn)生了多種組織替代物.使用生物墨水的3D 生物打印技術(shù)，其細胞相容性成為其臨床移植應(yīng)用的瓶頸，新型生物聚合物材料制備的水凝膠可突破上述局限，在3D 打印中通過共價交聯(lián)提高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在未來具有通過生物制造應(yīng)用于組織再生工程的前景.

固然，組織再生工程存在個體復(fù)雜性等因素，未來隨著精密制造、3D 打印和干細胞生物學等技術(shù)、生物材料的不斷研究和發(fā)展，會打破傳統(tǒng)的2D 細胞單層培養(yǎng)和動物疾病模型，會為特殊患者提供更多合適的治療方法，尤其是個性化組織的構(gòu)建.組織和器官的天然結(jié)構(gòu)具有多層次結(jié)構(gòu)、多種細胞類型和細胞外基質(zhì)，以及復(fù)雜的血管、神經(jīng)和淋巴管的網(wǎng)絡(luò)，動態(tài)的微環(huán)境可滿足細胞活性需求.通過基因工程獲得的新型活體生物材料可不斷修飾生物材料微環(huán)境，以滿足個性化的臨床需求，在組織再生工程中具有廣泛的應(yīng)用前景.