改性C18色譜柱對三七總皂苷含量測定的影響

廖宇寧 黃雨欣 廖林淇 陳苑君

改性C18色譜柱對三七總皂苷含量測定的影響

廖宇寧 黃雨欣 廖林淇 陳苑君

［廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，廣西 梧州 543000］

改性C18色譜柱是在C18結構中添加苯基后，大幅改變C18色譜柱對特定化合物的分離特性，文章通過三七總皂苷中人參皂苷Re的改變進行分析說明，將新構建的改性C18色譜柱與標準C18運行方法進行了多樣品含量對比，并對重現性、標準曲線穩定性、加標回收率進行了研究。結果顯示：該改性色譜柱大幅提升了人參皂苷Re分離度，并能縮短液相分析總時長；使用150 mm長度色譜柱就能夠獲得250 mm長度色譜柱的理論塔板數，所測含量結果偏差＜2%。

C18；苯基；人參皂苷Re；分離度

引言

三七作為一種傳統藥材，有著悠久的應用歷史，主要的功效是散瘀、止血、消腫、止痛和補虛。隨著現代醫藥理念的發展，人們研究三七中的有效成分，并將各成分根據所需功效進行分離提純以獲得特定功效的提取物，用于各種適應癥的治療與預防。該研究涉及成分分離以及含量測定，三七總皂苷為三七主要提取物，包含5種最主要的成分，分別是三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd。三七皂苷R1具有活血散淤、止血、消腫定痛的效果，并對心肌細胞有保護和修復作用；人參皂苷Rg1具有抗炎活性，可用于預防關節炎，對心血管系統方面具有保護作用，及形成抗動脈血栓促進心肌血管再生，抗細胞凋亡延緩神經干細胞衰老，并表現出抗癌特性，可抑制腫瘤細胞侵襲；人參皂苷Re具有舒張血管的作用，能促進血液循環，可抗疲勞、抗氧化、抗高血脂，在保護心血管系統的同時，還可以保護中樞神經系統。在治療阿爾茨海默癥研究中還發現，人參皂苷Re有降血糖、抗休克、抗血小板聚集等多種藥效作用；人參皂苷Rb1在心血管系統方面具有保護心肌、抑制心肌細胞凋亡、保護血管的作用，在中樞神經系統方面可以在腦缺血時提供保護作用，減少缺血對神經細胞的損傷，促進細胞修復，對腦卒中有良好的治療效果，還能促進記憶能力并增強認知，同時還具有抗腫瘤、抗糖尿病等藥理特性；人參皂苷Rd具有能夠擴張血管和保護腎臟功能，發揮抗腫瘤調節免疫的作用。

通過對5種主要成分的藥理作用進行分析，發現三七在心血管系統和中樞神經系統中都有著極為重要的藥用醫療價值，在具有相近藥理作用的同時，功效也有一些細微差別，隨著研究的深入將會發掘出更多功效和用法，勢必對各成分的提純分離和檢測有更高的要求。在現有《中華人民共和國藥典》中收錄的高效液相檢測條件[1]，對于三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd能夠實現較好的分離，但是人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的分離效果一直不理想，也是三七總皂苷液相含量檢測中分離的難點。盡管通過更換使用多種品牌的C18色譜柱，或者改變部分梯度變化來增加人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的分離效果，但是收效相對有限。在研究一款改性C18色譜柱時，發現其三七總皂苷圖譜中，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的保留時間比常規C18色譜柱大幅度減少，說明改性C18色譜柱對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re這3個成分有選擇性，改性C18色譜柱可以獲得與常規C18色譜柱有明顯差異的三七總皂苷圖譜，該差異可以用于提高分離效果和縮短分析時長，本文將通過以下實驗來解析證明這個推斷[2-3]。

1 實驗儀器與試劑

1.1 實驗儀器

所需的實驗儀器有：萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，AL204），超純水機（美國Millipore公司，Milli-Q IQ7000），2臺高效液相色譜儀（美國WATERS公司，Waters e2695及紫外檢測器2489），常規C18色譜柱Shim-pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），改性C18色譜柱ACE EXCEL5 C18-AR（4.6 mm×250 mm，5 μm），改性C18色譜柱ACE EXCEL3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）。

1.2 試劑

所需的試劑有：乙腈（德國默克公司，色譜純），甲醇（德國默克公司，色譜純），純化水（Millipore），三七總皂苷提取物試樣、三七總皂苷混合對照（中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 對照品配制與方法驗證用供試品配制

對照品：取約50 mg三七總皂苷混合對照，用萬分之一天平精密稱定至20 mL容量瓶中，加甲醇至容量瓶一半震搖至全部溶解后，再加甲醇至刻度搖勻，配制成濃度為2.5 mg/mL的對照溶液。

含量對比供試品：取8個批次的三七總皂苷提取物試樣，用萬分之一天平分別精密稱定約100 mg至25 mL容量瓶中，加甲醇至容量瓶一半震搖至全部溶解后，再加甲醇至刻度搖勻作為含量對比供試品。

重現性、加標回收供試品：取1個批次的三七總皂苷提取物試樣，用萬分之一天平精密稱取每份約70 mg共6份至25 mL容量瓶中，加甲醇至容量瓶一半震搖至全部溶解后，再加甲醇至刻度搖勻作為重現性供試品。用移液管分別從6個重現性供試品溶液中精密量取5 mL至6個10 mL容量瓶中，分別加入上述配制的2.5 mg/mL對照溶液至刻度，作為加標回收供試品。

2 方法與結果

2.1 常規C18色譜柱藥典方法下三七總皂苷圖譜

使用常規C18色譜柱Shim-pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）按《中華人民共和國藥典》三七總皂苷含量測定項下要求分析。圖譜見圖1。

圖1 常規C18藥典方法三七總皂苷圖譜

由圖1可知，參皂苷Rg1、人參皂苷Re的保留時間非常接近，分離度僅為1.6。雖滿足基本性能要求，但是與極限要求1.5非常接近，若要增加分離效果，分析方法需要進行調整。

2.2 常規C18色譜柱與改性C18色譜柱的對比

將藥典方法作適當調整，將流速降為1.0 mL/min，并改動部分梯度時間，延長比例分析時長，能更清楚地展現兩種柱子的差異性。分析使用Shim-pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）與改性C18柱ACE EXCEL5 C18-AR（4.6 mm×250 mm，5 μm）進樣對比色譜圖。圖譜見圖2、圖3。

圖2 常規C18三七總皂苷圖譜

圖3 改性 C18三七總皂苷圖譜

由圖2可知，調整方法后人參皂苷Rg1、人參皂苷Re保留時間明顯增加，分離度增加至2.5。通過圖3可以發現，前3個成分保留時間有明顯差異，證實改性C18色譜柱對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 3個成分有不同于常規C18的選擇性，圖3中3個成分保留時間大幅減少，但人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離度仍達到2.6，大于常規C18色譜柱所得的分離度（2.5）。改性C18色譜柱使用非最優分析方法就能得到優于常規C18色譜柱的分離效果，由此可以說明改性C18色譜柱在人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離上有著優異的效果。

2.3 優化分析方法后改性C18色譜柱性能

由圖4可知，分析總時長小幅縮減，但是人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離效果顯著，分離度達到3.8（見表1），對于藥典方法的分離度1.6，使用改性C18色譜柱在合適的分析方法下，可大幅度提高參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度。

圖4 優化分析方法后改性C18分析三七總皂苷圖譜

表1 優化分析方法后改性C18分析三七總皂苷圖譜數據

2.4 根據改性C18色譜柱性能壓縮分析時長

由圖4可知，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離度雖大幅提升，可分析時間依舊過長，改性C18色譜柱的分離效果即便縮短柱長亦能得到比常規C18長柱更好的分析柱效。柱長減短可以明顯縮短分析時長，但是會損失部分分離度與理論塔板數。為了彌補這個缺失，縮短柱長同時減小粒徑，粒徑的減小可以把損失的部分分離度與理論塔板數補回，讓短柱擁有和原來長柱相近的性能，壓力會有所提高，但只要控制在可接受范圍內即可，因此選用ACE EXCEL3 C18 AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）。

由圖5所示，3 μm改性C18短柱分析時長壓縮至50 min，與長柱分析時長90 min相比，用時縮減44.4%，對比兩個圖譜數據（結果見表1、表2），分析柱長縮短使人參皂苷Re分離度由3.8下降到3.3，降幅為13.2%，理論塔板數由14 245提升至16 671，增幅為17.0%，符合分析預期。分析運行壓力最高為3 300 psi約22.7 MPa，依據WATERS e2695耐壓上限5 000 psi是在液相承受范圍內。對比藥典方法，此方法使人參皂苷Re分離度翻倍提升，分析時長縮短，并且保留相關性能指標。

圖5 3 μm改性C18短柱分析三七總皂苷圖譜

表2 3 μm改性C18短柱分析三七總皂苷圖譜數據

注：空白表示無數據。

2.5 3 μm改性C18短柱方法學實驗

2.5.1 常規C18長柱與3 μm改性C18短柱的多批數據比對

使用色譜柱Shim-pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ACE EXCEL3 C18 AR（4.6 mm×150 mm，3 μm），分別取對照溶液與8批供試品溶液各10 μL分別注入2臺高效液相色譜同時進行分析，記錄峰面積數據，分別計算5種成分含量與總含量并計算相對平均偏差。結果見表3、表4。

由表3、表4數據可以看出，常規C18長柱與3 μm改性C18短柱，在分析同一供試品的含量時結果偏差較小，除三七皂苷R1偏差稍大外，其余4種成分和總含量相對偏差均在1%左右，考慮設備間存在的偏差，樣品的實際偏差會更小。

表3 兩款色譜柱8批供試品數據比對 單位：%

表4 8批供試品各成分及總含量相對平均偏差 單位：%

2.5.2 3 μm改性C18短柱三七總皂苷各成分線性

取對照溶液2、4、6、8、10 μL注入高效液相色譜考察線性關系，三七總皂苷各成分呈良好線性關系。結果見表5。

表5 3 μm改性C18短柱三七總皂苷各成分線性

2.5.3 3 μm改性C18短柱的重現性

取6份重現性供試品各10 μL，注入高效液相色譜記錄峰面積，計算5種成分含量與總含量，并計算相對標準偏差，6份供試品各成分及總含量相對標準偏差均在0.5%左右，擁有良好的重現性。結果見表6。

表6 3 μm改性C18短柱重現性數據表 單位：%

2.5.4 3 μm改性C18短柱加標回收實驗

取6份加標供試品各10 μL，注入高效液相色譜，記錄峰面積，計算5種成分含量與總含量，6份加標回收供試品回收率均在95%以上。結果見表7。

表7 3 μm改性C18短柱加標回收數據表 單位：%

2.5.5 3 μm改性C18短柱與常規C18長柱系統適應性比對

《中華人民共和國藥典》對三七總皂苷的要求為人參皂苷Rg1理論塔板數大于6 000，所有峰分離度大于1.5，分別使用對照品連續5針的系統適應性良好。5針圖譜重疊圖見圖6、圖7。數據結果見表8、表9。

圖6 常規C18長柱《中華人民共和國藥典》方法5針系統適應性圖譜

圖7 3 μm改性C18短柱5針系統適應性圖譜

表8 常規C18長柱《中華人民共和國藥典》方法5針系統適應性數據

注：空白表示無數據。

表9 3 μm改性C18短柱5針系統適應性數據

注：空白表示無數據。

3 討論

通過上述實驗證明，改性C18色譜柱中的苯基結構對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re這3種成分有明顯的選擇性，突破常規C18色譜柱的性能局限，對部分化合物的分析產生較大的影響，為保留時間接近分離困難的化合物提供一個新的選擇。在三七總皂苷分析中，改性C18色譜柱可大幅提高人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度，實現更好的分離效果。在分析方法優化得當的情況下，人參皂苷Re分離度可實現超過100%的躍升。根據實際的需求還可以對色譜柱長度和填料粒徑進行調整，從而在分析效率與效果之間尋求滿意的平衡點。該研究僅測試了分析三七總皂苷時所產生的變化，并利用該變化得到了常規C18色譜柱所不能達到的分析效果，這類改性C18色譜柱是一個很好的研究方向，在常規C18色譜柱結構中添加其他基團后，獲得部分其他類型柱的特性，從而突破原有的一些局限，為化合物的分析優化提供更多可能。

4 結束語

本實驗通過利用改性賦予的特性，使原本分離困難的物質達到更好的分離效果，理論上可用于所有含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的藥材，以及提取物含量的測定和提純制備，且無需過多成本，既經濟又實用。將來會有更多類型的改性C18色譜柱出現，隨著類型的增加，不同的特性將給C18色譜柱賦予更多的能力，為分離困難化合物的分析帶來更多新的發現。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 一部（2020年版）[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社，2020.

[2] 潘俊杰，鄭琴，楊明. 三七中三七總皂苷的提取、分離純化及分析方法的研究進展[J]. 世界科學技術—中醫藥現代化，2007(6): 77-82，87.

[3] 周迎春，趙懷清，梁寧，等. 高效液相色譜法同時測定三七總皂苷中人參皂苷Rg1、Re、Rb1與三七皂苷R1含量[J]. 沈陽藥科大學學報，2003(1): 27-31.

Effect of Modified C18 Chromatographic Column on the Determination of Content in Panax Notoginseng

The modified C18 chromatography column significantly changes the separation characteristics of specific compounds by adding benzene to the C18 structure. This article analyzes and explains the changes in ginsenoside Re in the total saponins of Panax notoginseng, compares the newly constructed modified C18 chromatography column with the standard C18 operating method for multiple sample content, and studies the reproducibility, stability of the standard curve, and recovery rate. The results showed that the modified chromatographic column significantly improved the separation of ginsenoside Re and shortened the total liquid phase analysis time. By using a 150mm length chromatographic column, the theoretical number of plates for a 250mm length chromatographic column can be obtained, and the deviation of the measured content results is less than 2%.

C18; phenyl; ginsenoside Re; resolution

P284

A

1008-1151(2023)11-0053-05

2023-03-28

廖宇寧（1983－），男，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司工程師，從事精密儀器分析工作。

陳苑君（1986－），女，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司工程師，從事質量控制管理工作。