藍莓果醋最適發酵溫度及抗氧化性研究

王龍宇，王宇婷，王云峰，熊思瑞，金鐵巖

延邊大學農學院（延吉 133002）

藍莓（Vacciniumspp.），外表為藍色的果實，有豐富的果漿，屬杜鵑花科，越橘屬植物。最開始出現在北美洲，是一種長年生長的灌木果樹。藍莓大致可分為2種：一種是野生品種，果實偏小，富含花青素，一般出現在低灌木中；另一種是人工培育品種，最高可長至240 cm高，果實較大，顆粒飽滿，在食用口感方面也比野生藍莓風味更佳，人體對于花青素的吸收率也相對較高[1]。1980年初，我國對藍莓進行初步研究，吉林農業大學小漿果研究所率先進入藍莓研究領域建立第一個藍莓產業化生產基地[2-3]。藍莓果實含有豐富的蛋白質、脂肪，以及大量的維生素A、維生素C、胡蘿卜素及其他人體所必需的微量元素。藍莓中還有熊果素、花色素、超氧歧化酶、黃酮類、多酚類等多種特殊的活性成分。所以藍莓能夠緩解視力疲勞及提高夜間視力；使人體免疫力得到有效提高，預防心血管疾病，也能延緩人體衰老、增強記憶；有效地防止由膠原和花生烯酸等引起的血小板凝固，以達到預防血栓的目的；可抑制加速癌細胞增殖的酶的活性；藍莓果實中熊果素主要功能就是通過抑制體內酪氨酸酶的活性，防止黑色素的生成，從而達到美白皮膚的作用[4]。

果醋是一種利用微生物在厭氧條件下經過酒精發酵、醋酸發酵而成的一種具有獨特風味的特殊調味食品。果醋飲料中的糖類在發酵時被微生物分解為有機酸，果醋產品中僅有少量的糖類沒有被轉化，同時各種維生素、礦物質、氨基酸等營養成分的營養物質損失也很小，最終保存在果醋的成品中，具有一定的經濟價值和食用價值[5]。

現代果醋的發酵方式主要有2種[6]：一是自然發酵，該方法操作簡單，但是發酵速率不易控制，原料容易腐敗且發酵周期時間相對較長；二是人工發酵，盡管該步驟操作瑣碎，但發酵時間短、容易控制且產品的產率高。國內工廠使用的是人工控制方法形成的系統的工藝生產線。

藍莓果醋（blueberry vinegar）是在果酒發酵完畢之后利用醋酸菌再次進行醋酸發酵；醋酸菌在進行代謝時能產生更多的有機酸，所含有的各種水解酶可以將藍莓中的蛋白質水解成各種氨基酸。這些氨基酸使成品的藍莓醋可以滿足對人體必需氨基酸的提供，大幅提高藍莓營養價值的利用率[7]。醋酸菌在進行發酵時除需要一定濃度的酒精作為底物外，還需要大量的其他營養物質，而藍莓中豐富的營養物質非常適合發酵制作果醋類飲品[8-9]。藍莓果醋是將藍莓的營養特性和果醋的營養特性融為一體的一種特殊的飲料，可稱作為一種功能性的飲料。經研究發現果醋中的多酚類物質通過其抗氧化作用對預防一些慢性疾病有很好的效果[10]。為此此次試驗不僅表明了藍莓果醋的最適酒精發酵溫度與醋酸發酵溫度，還對其進行了抗氧化性研究。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

栽培藍莓（天賜四號，購于延吉市西市場）；酵母菌種（Fermivin，Bio-Ingredients Specialist公司）；醋酸菌種（上海迪發釀造生物制品有限公司）；白糖（市售）；藍莓醋（陳釀10 d）；蘋果醋、食醋（食品級，市售）。

硫代硫酸鈉（AR級）、二次蒸餾水、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、三氯乙酸、無水乙醇（AR級），均為天津市科密歐試劑有限公司；水楊酸、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、濃鹽酸（上海市麥克林生化科技有限公司）；過氧化氫（天津市恒興化學試劑制造有限公司）；三氯化鐵（AR級，sigma公司）；DPPH、三羥基甲基氨基甲烷（均為AR級，Aladdin試劑公司）

1.1.2 主要儀器與設備

電子稱（AWH-SA型，上海英展機電企業有限公司）；分析天平（FA1104型，上海精科天平有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-6型，常州華普教學儀器有限公司）；半導體電子酒柜（JC-16C型，上海邦希電器有限公司）；數顯恒溫磁力攪拌器（HJ-3型，常州金壇市新航儀器廠）；酒精計（0.5%，3支裝，沈陽玻璃儀器制造廠）；pH酸度計（PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司）；紫外分光光度計（U-3900型，上海日立高科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 預處理

在藍莓中挑取出無破損，新鮮的藍莓果實，把挑好的藍莓破碎，攪拌到黏稠狀。因為酵母菌的生長代謝環境需要消耗大量葡萄糖，并且糖的濃度不宜過高，過高的糖原會使酵母菌代謝旺盛，酒精濃度持續升高，且變化速率過快，不宜進行控制；如果糖原過低則會導致酵母菌代謝速率過慢，發酵周期延長的同時會引起副產物即雜醇的產生[11]。因此在進行酒精發酵之前要加入適量的白糖來調整藍莓果漿中糖的濃度，將初始糖度調整至15%~16%，加入原料質量分數0.01%的硫代硫酸鈉殺菌4 h。

1.2.2 最適酒精發酵溫度的測定

稱取原料質量0.1%的Fermivin酵母菌，加入適量蒸餾水，在30 ℃水浴恒溫30 min活化酵母菌。等待出現大量泡沫，即活化充分。將活化好的酵母菌倒入之前調制好的藍莓漿液中，待攪拌均勻后放入恒溫酒柜中發酵。

在確定藍莓果酒酒精發酵的常用酵母菌種和接種量情況下，對酒精發酵影響最大的是發酵溫度，溫度的高低影響酵母菌的活性，即酵母菌的代謝速率的快慢。溫度過高導致酵母菌活性過快，酒精度的確定不易控制，并且溫度太高酵母菌直接失活；溫度過低，代謝速率慢，導致發酵周期延長。酒精發酵階段，設置4個溫度梯度，分別為10，15，20和25 ℃，在4種溫度下發酵時記錄每天的酒精度，根據發酵期間酒精度的變化速率確定酒精發酵時期的最適發酵溫度。

一般情況下，果酒發酵結束的酒精度在15%vol，其中有的會高一些，但是最高的一般也不會超過20%vol。酒精度過高會導致滲透壓過高，不適合醋酸菌進行正常的生理生化活動，因為醋酸菌的耐酒精能力很弱，適合醋酸菌發酵的酒精度約在6%vol，因此試驗需控制酒精度在5%vol~6%vol時就終止酒精發酵階段，將發酵好的果酒進行壓榨、過濾，放入冰箱中。

1.2.3 最適醋酸發酵溫度的測定

取上述待用的酒精度5%vol~6%vol的酒醪，在80 ℃條件下加熱30 min，將其溫度降至30 ℃。撒入醋酸菌粉末發酵，間隔一定的時間慢慢攪拌并通入適量氧氣。待種液的總酸含量上升至2%，即活化完畢，可接種使用，用于醋酸發酵階段。將擴大培養的醋酸菌按規定的比例加入待用的藍莓果酒中，定期攪拌均勻，進行醋酸發酵階段，待發酵結束后過濾，最終得到藍莓果醋。

醋酸發酵階段，向發酵好的藍莓果酒中添加一定的醋酸菌種，使其分別置于25，30，35和40 ℃溫度下進行醋酸發酵，每隔24 h測定發酵期間總酸含量，根據總酸含量的變化情況及發酵結束的最終含量確定醋酸發酵的最適溫度。總酸含量采用標準的NaOH滴定法測定。

1.2.4 藍莓果醋抗氧化性質的研究

試驗以對DPPH、·OH-、·O2-這3種自由基的清除能力大小為指標，利用得到的最適釀造溫度釀制出來的藍莓果醋與市售蘋果醋和食醋的自由基清除率對比，分析三者的抗氧化能力情況。

1.2.5 藍莓果醋DPPH清除率（R1）

藍莓果醋對DPPH自由基清除能力的測定參考賈冬英等[12]方法進行合理修改進行測定。藍莓果醋DPPH清除率（R1）按式（1）計算。

式中：A0為乙醇+DPPH的吸光度；A1為樣液+DPPH的吸光度；A2為樣液+乙醇的吸光度。1.2.6 藍莓果醋·OH-清除率（R2）

藍莓果醋對羥自由基·OH-清除能力的測定采用水楊酸法并且做出合適修改進行測定[13]。藍莓果醋·OH-清除率（R2）按式（2）計算。

在510 nm波長下，測定樣品溶液的吸光度A1，蒸餾水代替H2O2測定得吸光度A2，蒸餾水進行空白調零。蒸餾水代替樣液得到的吸光度記作A0。

1.2.7 藍莓果醋·O2

-清除率（R3）藍莓果醋對超氧陰離子自由基清除能力測定采用鄰苯三酚自氧化法進行測定[14]。藍莓果醋·O2-清除率（R3）按式（3）計算。

依據方法配制好的溶劑在299 nm波長下測定吸光度A1，蒸餾水代替鄰苯三酚測定吸光度A0，蒸餾水代替果醋樣液測定吸光度A2。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對酒精發酵的影響

在不同溫度條件下酒精發酵時酒精度上升變化的曲線如圖1所示。經過5 d發酵，15 ℃時酒精升高的速度最快，20 ℃次之，10 ℃和25 ℃條件下前3 d均無明顯變化，第4天變化明顯。通過參考周景瑞等[15]的研究發現，隨著發酵溫度的升高，酒精度呈現先上升后下降趨勢。通過對比發現15 ℃時酒精升高的速率變化過快，不易控制，且最高酒精度達7%vol，但是10 ℃和25 ℃最高的酒精度數滿足不了后續醋酸發酵的條件，在較短的時間內20 ℃的條件下的酒精發酵溫度可達6%vol，且變化速度容易掌控，因此酒精最適發酵溫度為20 ℃。

圖1 不同發酵溫度對酒精發酵的影響

2.2 不同溫度對醋酸發酵的影響

如圖2所示，不同溫度條件下果醋中總酸含量均呈上升趨勢。發酵開始的前2 d變化趨勢不明顯，第3天開始總酸含量明顯升高。從曲線的變化趨勢可以看出：在35 ℃條件下總酸含量上升最顯著，醋酸菌的生理活性最高；25 ℃時，上升最慢，由微生物學知識可知該溫度條件下醋酸菌的生理代謝緩慢，溫度達到40 ℃時，出現部分醋酸菌失活，代謝速率變低。綜上所述，醋酸發酵階段的最適發酵溫度為35 ℃。

圖2 不同發酵溫度對醋酸發酵階段的影響

2.3 食醋、蘋果醋和藍莓果醋的自由基清除能力情況

從表1可以看出，藍莓果醋對DPPH清除率為51.7%，對·OH-清除率為76.4%，對·O2-清除率為27.5%。蘋果醋對DPPH清除率為49.4%，對·OH-清除率為71.4%，對·O2-清除率為24.4%。食醋對DPPH清除率為45.9%，對·OH-清除率為59.7%，對·O2-清除率為20.3%。結果表示，3種樣品的自由基清除率之間都存在顯著性差異。其中，藍莓果醋的清除能力最好，這可能和藍莓中含有多種還原能力較強的活性成分如多酚、花色素和黃酮類等物質有關。

3 結論

利用微生物發酵將藍莓進行兩步發酵，最終得到藍莓果醋。試驗測定藍莓最適酒精發酵溫度，并確定最適醋酸發酵溫度。對藍莓果醋的抗氧化性質進行分析，分別測定DPPH、·OH-、·O2-自由基清除能力試驗，與市售蘋果醋和食醋進行對比后發現藍莓果醋的清除能力最好，說明試驗方法釀制的藍莓果醋有很好的抗氧化能力。

結果表明：藍莓果醋的最適酒精發酵溫度為20 ℃；在此條件下發酵制成的藍莓果酒酒精度達到5%vol~6%vol時，進行壓榨、過濾后終止發酵；此時的酒液呈明亮深紅色，其酒精度比較容易控制，更適合進行后續的醋酸發酵。藍莓果醋最適醋酸發酵條件為溫度35 ℃，此條件下發酵釀制的藍莓果醋外觀品相最好，口感最佳；抗氧化性試驗結果表明，藍莓果醋的自由基清除率分別為51.7%（DPPH），76.4%（·OH-）和27.5%（·O2-），高于市場銷售的蘋果醋和食醋，說明試驗方法釀制的藍莓果醋有很好的抗氧化能力。

綜上所述，利用試驗優化的發酵溫度可大幅改善藍莓醋風味，所得到的果醋酸甜適中，并且該溫度釀制的藍莓果醋的抗氧化能力高于市售的蘋果醋和食醋，是一種具有飲品開發價值的保健型果醋。一旦應用于工廠工藝上，不僅能減少藍莓的浪費現象，也有助于推動藍莓產業的發展。