3種黃精多糖含量及抗氧化活性的差異分析

李旭鴻，馮源源, ，黃月, ，龔意輝，陳致印

1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院（婁底 417000）；2. 南昌大學(xué)食品學(xué)院（南昌 330031）；3. 海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（海口 570228）

黃精為一種雙子葉百合科草本植物，品種豐富。多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）、雞頭黃精（Polygonatum sibiricumRed.）和滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl）是納入我國藥典[1]的三種主要黃精品種，其根莖作為我國的傳統(tǒng)中藥，具有增強免疫、改善記憶力、抗抑郁、降血糖和保護肝臟等功效[2]。我國于2017年將黃精列入新資源食品。此外，黃精作為一種藥食同源作物，具有廣闊的應(yīng)用價值，其產(chǎn)業(yè)成為當(dāng)?shù)氐闹鞔虍a(chǎn)業(yè)之一。

黃精的主要成分有凝集素、皂苷、黃酮和多糖[3]，其中多糖含量最高[4]，在4.47%~21.34%[5]。黃精多糖具有良好的抗氧化活性，可以清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基和超氧自由基，并顯現(xiàn)還原力[6]。此外，黃精多糖還具有抗衰老、抗疲勞、抗菌和抗過敏等多種生物活性[7]，對人體有提高學(xué)習(xí)記憶能力、防治骨質(zhì)疏松、延緩衰老和保護肝臟等重要藥理作用[8]。但不同品種來源的黃精多糖含量與活性存在差異，而相關(guān)的對比研究較少。

試驗以多花黃精、雞頭黃精和滇黃精為研究對象，對比分析其多糖含量和抗氧化活性的差異，為科學(xué)評價不同品種黃精的質(zhì)量和藥用價值、選擇合適的加工利用方式提供理論參考，促進當(dāng)?shù)攸S精產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞頭黃精、多花黃精、滇黃精（新化綠源農(nóng)林科技有限公司）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（福建領(lǐng)江生物科技有限公司）；苯酚、乙醚、丙酮、水楊酸、硫酸亞鐵、三氯乙酸、氯化鐵、乙醇、鐵氰化鉀、過硫酸鉀（均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：均為分析純，合肥巴斯夫生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（分析純，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；硫酸、過氧化氫（分析純，湖南匯鴻試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚（均為分析純，北京酷來博科技有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

754型紫外分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；DE-500 g型萬能高速粉碎機（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）；DL-1型萬用電磁爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；CP214型電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；HH-8型電熱恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃精多糖的粗提取

參考楊新新等[9]的試驗方法稍作調(diào)整。將3種黃精分別置于粉碎機中粉碎過0.250 mm孔徑（60目）篩，并在60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至恒重后，各取10 g加入300 mL乙醇置于水浴中回流脫脂脫色，濾紙上無油跡和色斑時，將粉末干燥，加入300 mL蒸餾水在80 ℃條件下浸提3次，每次2 h，提取液合并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮至300 mL。按體積比1︰4加入乙醇，邊加邊攪拌，在4 ℃條件下醇沉12 h后，按5 000 r/min離心20 min得黃精多糖，依次用乙醚、丙酮和乙醇洗滌、離心，干燥即得多花黃精多糖（Polygonatum cyrtonemapolysaccharides，PCP）、雞頭黃精多糖（Polygonatum sibiricumpolysaccharides，PSP）和滇黃精多糖（Polygonatum kingianumpolysaccharides，PKP）。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

試驗采用苯酚硫酸法[10]。取無水葡萄糖與適量蒸餾水配制0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并精確吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL分別置于10 mL比色試管中，并補充蒸餾水至2 mL。用蒸餾水制備5%苯酚，并取1.0 mL與5.0 mL濃硫酸依次加入含待測溶液的比色管中，待管內(nèi)試樣冷卻至室溫后，以蒸餾水作空白試劑，在490 nm波長條件下檢測各葡萄糖梯度濃度的吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。擬合出回歸方程y=16.888 6x-0.019 7（R2=0.990 1）。當(dāng)葡萄糖濃度分布在0.01~0.05 mg/mL區(qū)域時，吸光度分布與葡萄糖濃度變化具有良好線性關(guān)系。

1.3.3 黃精多糖含量測定

參考錢華麗等[11]的試驗方法稍作調(diào)整。3種黃精的細(xì)粉各取1 g，分別加入乙醇沸水浴1 h，迅速進行過濾，洗滌3次，濾液置于500 mL容量瓶中，取1 mL于50 mL容量瓶內(nèi)定容，即為待測溶液。取1 mL待測溶液，按照上述苯酚硫酸法檢測吸光度（A）后，代入回歸方程后即可計算樣品中多糖含量。重復(fù)試驗3次，檢測結(jié)果取平均值。多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）與多糖含量（%）的計算見式（1）和（2）。

式中：A為樣品吸光度，L/（g·cm）；C為多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品溶液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；1 000為細(xì)粉質(zhì)量，mg。

1.3.4 體外抗氧化測定

DPPH自由基清除能力的測定參考Chen等[12]的試驗方法稍作調(diào)整；ABTS自由基清除能力的測定參考Xie等[13]的試驗方法稍作調(diào)整；羥基自由基清除能力的測定參考Ling等[14]的試驗方法稍作調(diào)整；超氧自由基清除能力的測定參考Wang等[15]的試驗方法稍作調(diào)整；總還原能力的測定參考Peng等[16]的試驗方法稍作調(diào)整。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2018軟件整理，采用Origin Pro 2021繪圖，采用Multiple comparisons和t檢驗分析差異的顯著性，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量

3種黃精多糖含量如圖2所示。雞頭黃精的多糖含量最高，達(dá)15.02%，且與滇黃精和多花黃精存在顯著差異（P＜0.01），滇黃精的多糖含量為11.18%，多花黃精的多糖含量最低，為9.88%。何俊婷等[17]測定不同產(chǎn)地種植的多花黃精多糖含量，其多糖含量在9.75%~12.25%之間，雞頭黃精的多糖含量分布在9.42%~17.18%之間[17-18]。黃竹珺等[19]測定云南11個地區(qū)的滇黃精多糖含量，多糖含量在7.043 9%~10.317 1%之間。由此得出，不僅黃精不同品種間的多糖含量差異較大，同品種不同產(chǎn)地間的黃精多糖含量也存在差異，原因可能與黃精生長的地理、環(huán)境有關(guān)。錢楓等[20]指出，相較于地域性因素，品種的差異對多糖含量的影響更大，其他影響因素的相關(guān)性有待進一步探究。

2.2 DPPH自由基清除能力

如圖3所示，多糖濃度在1~5 mg/mL時，3種黃精多糖對DPPH自由基的清除能力隨多糖濃度增大而增強，PSP的清除能力始終強于PCP和PKP，PCP的清除率始終保持最低，且與PSP和PKP存在顯著差異（P＜ 0.01）。多糖濃度達(dá)到5 mg/mL時，PCP、PSP和PKP的清除率依次為9.77%，26.54%和23.91%，PSP和PKP對DPPH自由基的清除能力超過PCP清除率的2倍。多糖可為DPPH自由基提供電子，使一系列自由基反應(yīng)終止，不同品種的黃精多糖對DPPH自由基的清除能力存在差異，可能是多糖不同的分子質(zhì)量、碳水化合物組成和官能團組成所導(dǎo)致[21-22]。試驗結(jié)果與已報道結(jié)論[23-25]存在一定差異，其原因可能是3種黃精多糖對DPPH自由基的清除能力與黃精產(chǎn)地和黃精多糖的提取工藝的不同有關(guān)。

2.3 ABTS自由基清除能力

由圖4可知，質(zhì)量濃度1~5 mg/mL時，3種黃精多糖對ABTS自由基的清除能力與多糖濃度呈正相關(guān)，且PSP和PCP的清除率呈線性增長。在試驗濃度內(nèi)，PSP的清除能力始終強于PCP和PKP，PCP的清除率始終保持最低，且與PSP存在顯著差異（P＜0.05）。多糖最具活性的空間構(gòu)象是三股螺旋[26]，試驗中，PCP對ABTS自由基的清除率最低，據(jù)王飛鳳[27]的猜測，清除率低可能與其三股螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量較少甚至不含有相關(guān)。

2.4 羥基自由基清除能力

3種黃精多糖對羥基自由基的清除能力均表現(xiàn)出濃度依賴性，如圖5所示。在試驗濃度范圍內(nèi)，PSP的清除能力強于PCP和PKP，PCP的清除率最低，且在大部分濃度下，兩兩之間存在顯著差異（P＜0.05）。多糖質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL時，PCP、PSP和PKP的清除率依次為37.3%，67.7%和60.2%，PSP對羥基自由基的清除能力接近PCP清除率的2倍。由此可知，3種黃精多糖對羥基自由基的清除能力都強于各自對DPPH自由基的清除能力。PCP和PSP的清除率分別強于李玲[28]和王艷等[29]的結(jié)果，PKP的清除率略低于陶愛恩[30]的結(jié)果，導(dǎo)致此差異的原因可能是3種黃精多糖對羥基自由基的清除能力與黃精產(chǎn)地、黃精多糖提取方式和具體工藝參數(shù)有關(guān)。

圖5 3種黃精多糖對羥基自由基的清除作用

2.5 超氧自由基清除能力

隨著多糖濃度增加，3種黃精多糖清除超氧自由基的能力也隨之增強，如圖6所示。在試驗濃度范圍內(nèi)，PSP的清除能力強于PCP和PKP，且在各組多糖濃度下，與PCP和PKP均存在顯著差異（P＜0.05）。多糖質(zhì)量濃度超過3 mg/mL后，PSP清除率達(dá)60%左右，增長趨于平緩，但遠(yuǎn)高于PCP和PKP，PCP清除率也逐漸強于PKP，且具有顯著性（P＜0.05）。李智敏等[24]優(yōu)化黃精多糖提取工藝所提取的PKP對超氧自由基的清除能力略強于試驗結(jié)果，說明合適的黃精多糖提取工藝會促進黃精多糖對超氧自由基清除能力的釋放。

圖6 3種黃精多糖對超氧自由基的清除作用

2.6 總還原能力

如圖7所示，3種黃精多糖的總還原能力隨濃度增大而增強。試驗濃度范圍內(nèi)，PSP的總還原能力不僅在各組濃度內(nèi)，而且整體上均顯著強于PCP和PKP（P＜0.05）。隨著多糖濃度提高，PKP的總還原能力由弱于PCP轉(zhuǎn)為強于PCP，并逐漸顯現(xiàn)差異性（P＜ 0.05），表明多糖濃度越高，PKP的總還原能力越突出。在相同濃度下，試驗結(jié)果高于張遙遙[31]和王飛鳳[27]將黃精多糖提純后測定的還原力，說明在黃精粗多糖中，除多糖外其他物質(zhì)也具有總還原能力，但具體物質(zhì)還有待進一步探索。

圖7 3種黃精多糖的總還原能力

3 結(jié)論與討論

對多花黃精、雞頭黃精和滇黃精進行對比，多糖含量均超過7%，達(dá)到我國最新藥典的最低標(biāo)準(zhǔn)。按含量高低排列，依次是雞頭黃精＞滇黃精＞多花黃精。多花黃精多糖、雞頭黃精多糖和滇黃精多糖對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧自由基有不同程度的清除作用，且具備還原能力，呈一定的劑量關(guān)系，說明3種黃精多糖均具有抗氧化活性。整體而言，雞頭黃精多糖的清除能力最好，表明其抗氧化活性最好，其次為滇黃精多糖，多花黃精多糖的抗氧化活性最低。這為黃精品種的質(zhì)量評價、選擇和加工利用提供依據(jù)。但不同品種黃精多糖其他重要的生物活性是否也存在差異、怎樣選擇和加工黃精使其多糖達(dá)到最佳活性等問題仍有待進一步研究。