不同飼喂條件下蜂王漿品質及抗氧化能力評價

喬棟 ，黎洪霞，劉肇龍，宋梅，龐杰，陳蘭珍

1. 福建農林大學食品科學學院（福州 350002）；2. 中國農業科學院蜜蜂研究所（北京 100093）

蜂王漿是年輕工蜂出生后第5天至第14天之間由咽下腺和下頜腺分泌的黃白色酸性物質，用于喂養工蜂前三天的幼蟲和蜂后的一生[1]。蜂王漿富含多種營養物質[2]，大量相關研究表明蜂王漿具有抗氧化活性[3]、胰島素樣作用、改善糖尿病、降血脂及免疫調節等功能特性。蜂王漿的內在組分決定了生物活性功能[4]，但是蜂王漿的生產質量受到多方面的影響，如蜂群群勢、足夠的食物供應（包括蜂蜜和花粉）、適宜的溫度（20~30 ℃），以及良好的自然環境（無農藥或微量農藥）等。已有研究表明，蜜粉源的差異會影響蜂王漿質量[5-6]。在外界蜜粉源缺乏時，為保證蜂王漿的持續性產出，蜂農會進行人工飼喂來補充蜂群生產必需的蛋白質和糖分，但是在生產中添加人工飼料是一個有爭議的話題[7]。已有研究表明工蜂在不同采食下會影響蜂王漿產量，部分糖分發生變化，其次人工飼料可能會刺激下咽腺發育[8-10]。

對于飼喂產生的蜂王漿質量仍沒有明確定論。此次研究通過比較工蜂采食天然蜜粉源、飼喂糖水和飼喂代花粉三種不同飼喂條件下蜂王漿的品質差異，并通過體外抗氧化測定方法研究了不同蜂王漿的體外抗氧化活性差異，對不同飼喂條件下蜂王漿的質量變化差異提供數據支撐，為生產優質蜂王漿提供理論指導。

1 材料與方法

蜂王漿樣品均采集于湖北省鐘祥市，根據蜂群不同采食情況對所產蜂王漿進行分類，即天然組和飼喂組，天然組指蜂王漿在生產過程中蜂群食物完全來自天然蜂蜜和蜂花粉，飼喂組指蜂王漿在生產過程中人為添加白糖水和代花粉飼喂蜂群。試驗樣品有采食天然花粉和花蜜生產的蜂王漿（TRWJ）、采食天然花粉并人工飼喂白糖水生產的蜂王漿（WTWJ）和采食天然蜂蜜并人工飼喂代花粉生產的蜂王漿（WFWJ），三種類別蜂王漿共計76個樣品。樣品信息見表1，樣品采集完成后立即保存在-18 ℃冰箱中備用直到檢測。

表1 蜂王漿樣品采集信息

Biofuge離心機（美國Thermo Scientific公司）；KQ218超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Vortex Mixer QL-866渦旋混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；PX124ZH電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；Synergyneo2 Alpha酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；752紫外可見分光光度計（上海菁華科技有限公司）。

牛血清白蛋白Ⅴ（北京索萊寶科技有限公司）；考馬斯亮藍G250、維生素C、2, 2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽、靛藍胭脂紅、乙酸鈉（上海源葉生物科技有限公司）；磷酸、苯酚（上海吉至生化科技有限公司）；濃硫酸（國藥集團化學試劑有限公司）；葡萄糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；沒食子酸、水楊酸（河北百靈威超精細材料有限公司）；硫酸亞鐵（西隴科學股份有限公司）；30%過氧化氫、過硫酸鉀（福晨化學試劑有限公司）。

1.1 試驗方法

1.1.1 水溶性蛋白含量測定

參考文獻[11-12]方法，并略作修改。稱取0.1 g牛血清白蛋白溶解于純水定容至100 mL，梯度為0，40，80，120，160，180和200 μg/mL，各取0.2 mL不同質量濃度稀釋液于1.5 mL試管中，加入1 mL考馬斯亮藍反應液，立即渦旋15 s，混勻后靜置5 min，在波長595 nm處測定吸光度，以牛血清蛋白系列濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制的標準曲線方程：y=3.449x+0.661，相關系數R2=0.999。

稱取0.5 g蜂王漿定容10 mL純水中，渦旋2 min，4 ℃下超聲10 min，12 000 r/min下離心20 min，取上清液并將上清液進行稀釋，取50 μL加入950 μL純水渦旋混勻待測。按照制作標準曲線的操作方法對樣品測定水溶性蛋白含量，將測定的吸光度代入標準曲線方程，計算其含量。

1.1.2 總糖含量測定

參考方法[13-14]進行改進。稱取50 mg葡萄糖溶于純水并定容至50 mL，配制梯度濃度為0，80，160，240，320和400 μg/mL葡萄糖標準溶液，配制80%苯酚作為儲備液，使用前稀釋成5%苯酚工作液，在具塞試管中依次加入0.2 mL不同濃度的葡萄糖標準溶液和0.2 mL 5%苯酚，再迅速加入1 mL濃硫酸，渦旋使其充分混勻，靜置10 min，在波長490 nm處測定吸光度，以葡萄糖標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線方程：y=0.006x+0.063 6，相關系數R2= 0.999。

稱取0.5 g蜂王漿定容于10 mL去離子水，渦旋混勻后超聲10 min，12 000 r/min下離心20 min，取上清液稀釋20倍，按照標準曲線操作方法對樣品進行測定，將吸光度帶入標準曲線方程計算含量。

1.1.3 葡萄糖氧化酶測定

參考權淑靜等[15]，采用褪色光度法，并略作改動。準確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL過氧化氫工作液于具塞比色管，依次加入0.3 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和0.26 mL靛藍胭脂紅溶液，補水至總體系為5 mL，混勻后置于100 ℃沸水中加熱13 min，取出后用冰水冷卻3~5 min，終止反應，在波長612 nm處用蒸餾水做參比，測定其吸光度。以過氧化氫溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線方程：y=-0.360 4x+0.847，相關系數R2=0.990。將蜂王漿樣品上清液稀釋為25 mg/mL，取0.4 mL于具塞試管中，在37 ℃恒溫培養箱中加熱孵育30 min，取出后按照上述操作過程，依次加入工作液，計算產生過氧化氫的含量，計算葡萄糖氧化酶的活性。酶活力單位規定為：37 ℃條件下，1 min內催化葡萄糖反應產生1 μg過氧化氫所需的酶量為1 U。

1.1.4 總酚酸測定

參考Balkanska等[16]方法。稱取50 mg沒食子酸溶于乙醇中定容于50 mL容量瓶，配成1 000 μg/mL沒食子酸標準品儲備液，將儲備液用純水稀釋成0，10，20，40，60，80和100 μg/mL質量濃度梯度，取0.2 mL不同質量濃度標準品于試管中，依次加入0.2 mL 1 mol/L福林酚顯色液和1 mL 1 mol/L碳酸鈉溶液，用水補至3 mL，混勻后靜置避光反應30 min時，在波長760 nm處測定吸光度，標準曲線方程為y=0.006 8x+0.066 8，相關系數R2=0.998。

配制100 mg/mL蜂王漿溶液樣品并稀釋成20 mg/mL，按照標準品的反應過程依次添加反應溶劑，反應后上機檢測吸光度。

1.1.5 蜂王漿抗氧化活性

1.1.5.1 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力測定方法采用ABTS自由基清除率法[17]。配制7 mmol/L的ABTS儲備液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液，取等體積溶液于黑暗中反應12~16 h，得ABTS反應液（ABTS+·），反應液以1∶45體積比用去離子水稀釋至在734 nm下吸光度為0.70±0.02。以維生素C為當量并制作標準曲線，維生素C質量濃度梯度為0，10，20，40，60和80 μg/mL，取10 μL標準品加入200 μL反應液避光反應8 min，在波長734 nm處測定吸光度。配制100 mg/mL樣品，按照上述操作方法進行反應，避光反應8 min后測定蜂王漿樣品吸光度，抗氧化能力以VC當量表示。

1.1.5.2 羥基自由基·OH清除率

參考湯興楠等[18]方法配制9.0 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L的過氧化氫儲備溶液。操作過程：配制VC標準溶液作為對照，稱取1.0 g維生素C定容于50 mL容量瓶，稀釋成0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和0.9 mg/mL質量濃度梯度，選擇10 mL試管依次加入0.5 mL樣品或標準品、適量水、0.5 mL的9 mmol/L硫酸亞鐵和0.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，加入0.5 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液，混勻后在37 ℃水浴靜置30 min，在波長510 nm處測定反應體系的吸光度，反應重復測定3次。清除率根據式（1）計算，反應溶劑添加劑量如表2所示。

表2 反應溶劑添加劑量

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為蜂王漿樣品的吸光度；A2為未加反應液的吸光度。

1.2 數據處理

獲得數據通過SPSS 24.0軟件做單因素方差分析（One-way ANOVA）和相關性分析，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異，利用Graphpad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同飼喂條件對蜂王漿成分影響

蜂王漿中的主蛋白（MRJPS）為水溶性蛋白質，目前已經鑒定出9種不同蛋白質（MRJP1~MRJP9），研究表明蜂王漿水溶性蛋白質具有多種生物活性功能[19]。水溶性蛋白是由工蜂的咽下腺和上顎腺分泌，而蜜蜂發育和分泌蜂王漿所需的蛋白質、能量來源于外界花粉，已有研究表明蜜蜂食用不同蜂花粉會顯著影響主蛋白基因表達[20]。試驗探究了不同飼喂條件對工蜂分泌蜂王漿水溶性蛋白的影響，結果如表3所示。天然組、飼喂糖水和代花粉三組的水溶性蛋白含量在54.85~59.48 mg/g之間，飼喂代花粉組水溶性蛋白含量最高，為59.48 mg/g，與WTWJ組存在極顯著性差異（P＜ 0.01），表明飼喂代花粉相比飼喂糖水能夠顯著提高水溶性蛋白含量。TRWJ與WTWJ之間存在極顯著差異（P＜0.01），說明采食天然花粉花蜜生產蜂王漿水溶性蛋白含量優于飼喂糖水生產的蜂王漿。TRWJ與WFWJ之間不存在顯著性差異，與天然蜜粉源相比較飼喂代花粉不會影響水溶性蛋白含量。

表3 不同飼喂條件所產蜂王漿組分含量

工蜂咽下腺是分泌蜂王漿的主要器官之一，有研究表明不同食料會改變工蜂咽下腺的腺泡表面積，對工蜂的生長發育和蜂王漿的生產有一定的影響[21]。蜜蜂營養缺乏會對工蜂下頜腺的合成能力有顯著的負面影響[22]。以上結果表明飼喂白糖后對工蜂分泌蛋白產生影響導致含量降低。因為氨基酸是蛋白質基本組成成分，其濃度變化可以反映蜂王漿蛋白質含量變化[23]，有研究證實分別喂食工蜂蜂蜜和白糖會導致蜂王漿氨基酸含量存在顯著差異且蜂蜜組含量優于白糖組[24]，與此次研究結果相似，喂食白糖組蜂王漿水溶性蛋白含量最低，表明飼喂條件不同是導致水溶性蛋白含量差異的重要原因。

糖類占蜂王漿的7.5%~15%，葡萄糖和果糖約占總糖90%，此外還有其他少量的糖，如蔗糖、麥芽糖和海藻糖等[25]。如表3所示，蜂王漿總糖含量在110.50~ 112.69 mg/g之間，TRWJ、WTWJ和WFWJ三組之間不存在顯著性差異，而且WTWJ含量略低于TRWJ，表明飼喂糖水不會導致蜂王漿總糖含量升高。研究結果表明不同飼喂條件不會影響蜂王漿總糖的含量。

葡萄糖氧化酶是蜜蜂咽下腺分泌的一種酶，參與D-葡萄糖轉化為葡萄糖酸和過氧化氫，在冷凍條件下其活性保持穩定[26]。如表3所示，不同蜂王漿葡萄糖氧化酶活性在1 022.24~1 092.70 U/（g·0.5 h）之間，天然組、喂糖和喂代花粉組內無明顯差異，表明不同飼喂條件不會影響葡萄糖氧化酶活性。此外，通過表3數據看出三組蜂王漿的總糖與葡萄糖氧化酶含量無顯著性差異，但含量存在相反的趨勢。有研究表明葡萄糖氧化酶活性受到底物葡萄糖的影響產生底物抑制[27]，并且葡萄糖氧化酶通過化學反應會消耗葡萄糖產生過氧化氫，使蜂王漿中葡萄糖含量下降，說明葡萄糖氧化酶含量可能與蜂王漿中總糖含量存在一定關聯性。

如表3所示：不同蜂王漿總酚酸含量差異不明顯，平均含量在3.18~3.23 mg/g之間，與Nabas等[28]測定結果相符合，天然組、喂糖和喂代花粉組內無明顯差異，說明不同飼喂條件不會顯著影響總酚酸的含量。

2.2 不同飼喂條件對蜂王漿體外抗氧化活性影響

如圖1所示：蜂王漿總抗氧化能力以VC當量表示，在1.91~2.28 mg/g之間，羥自由基清除率在60.81%~ 62.26%之間，WFWJ的總抗氧化能力最高，VC當量為2.28 mg/g，與TRWJ存在極顯著性差異（P＜0.01），與WTWJ之間無顯著性差異。結果表明人工飼喂代花粉生產的蜂王漿其體外總抗氧化能力均高于喂糖和天然蜜粉源生產的蜂王漿，而喂食糖水與天然蜜粉源生產的蜂王漿相比其體外總抗氧化能力有略微升高，但無顯著性差異。不同飼喂條件能夠影響蜂王漿體外總抗氧化能力。

圖1 不同飼喂蜂王漿體外抗氧化指標

蜂王漿的羥自由基清除率在60.81%~62.26%之間，如圖1所示，不同飼喂條件下生產的蜂王漿羥自由基清除率無顯著差異，表明不同飼喂條件不會對蜂王漿羥自由基清除能力產生影響。

2.3 相關性分析

為進一步分析不同飼喂蜂王漿成分之間的關系，對蜂王漿測定的各項指標做Pearson相關性分析，如表4所示。葡萄糖氧化酶活性與總糖含量呈極顯著負相關，葡萄糖氧化酶和總糖中的葡萄糖發生潛在抑制或降解反應導致存在負相關性，而相關性系數（r= -0.304）較小的原因可能是蜂王漿中其他物質也會影響葡萄糖氧化酶活性。葡萄糖氧化酶與總抗氧化能力（r=0.349）、羥自由基清除率（r=0.625）都存在極顯著正相關，主要由于葡萄糖氧化酶分解葡萄糖產生的過氧化氫提高了體外抗氧化能力?？偡优c總糖呈極顯著負相關（r=-0.396），有研究表明多酚能夠與蛋白相互作用抑制酶活性，其次多酚能夠產生過氧化氫減緩葡萄糖分解速率[29]，這可能是導致總酚和總糖負相關的原因?？偡优c蜂王漿水溶性蛋白或游離氨基酸發生共價作用能夠提高蛋白的熱穩定性[30]，使得蜂王漿容易熱分解的蛋白質組分能夠穩定保存，導致總酚與水溶性蛋白呈極顯著正相關。

表4 不同飼喂蜂王漿指標相關性分析

3 結論

研究表明不同飼喂條件會影響蜂王漿水溶性蛋白含量，喂代花粉生產的蜂王漿水溶性蛋白最高，采食天然蜜粉源生產的蜂王漿次之，喂糖生產的蜂王漿水溶性蛋白最低。不同飼喂條件對蜂王漿總糖、總酚、葡萄糖氧化酶活性沒有顯著影響，說明飼喂條件不是影響其含量的主要因素。蜂王漿的總抗氧化性與飼喂條件有關，喂粉生產的蜂王漿總抗氧化能力最高，其次是喂糖生產的蜂王漿，采食天然蜜粉源生產的蜂王漿總抗氧化能力最低。但是在羥自由基清除能力上不同飼喂蜂王漿之間無顯著性差異，后續將通過多種抗氧化方法進一步研究不同飼喂蜂王漿的抗氧化能力。相關性分析表明蜂王漿內在組分之間存在關聯，葡萄糖氧化酶與總糖之間存在極顯著負相關，與抗氧化能力存在極顯著正相關，總酚和總糖存在極顯著負相關。蜂群在人工飼喂代花粉和糖水后生產的蜂王漿品質沒有下降，在養蜂生產蜂王漿階段可以考慮人工飼喂。