線粒體轉錄因子A在腫瘤發生發展中作用的研究進展

高 榴，禹 莉*

(1.蚌埠醫學院臨床醫學院，安徽 蚌埠 233030，2.蚌埠醫學院檢驗醫學院，安徽 蚌埠 233030)

線粒體是一種廣泛存在于各類真核細胞中的細胞器，存在于所有有核的人類細胞中，參與穩態調節、生物合成、活性氧自由基生成、氧化磷酸化以及細胞凋亡的發生等生物學過程[1]。據研究，線粒體的遺傳物質，即線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)，具有復制、轉錄及蛋白質合成的功能，其表達調節對于發育和分化過程中的線粒體生物生成至關重要。但線粒體僅能編碼部分蛋白質，主要的線粒體蛋白質均由細胞核基因編碼[2]，線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcriptionfactor A，TFAM)則是一種被證明可以調節體內mtDNA拷貝數的哺乳動物蛋白質，也是細胞核基因編碼的線粒體蛋白質[3]。據報道，在多種人類腫瘤細胞中，包括前列腺癌[4]、肝癌[5]、結腸癌[6]等，mtDNA 與TFAM 表達水平均有改變，這表明TFAM基因表達水平與多種腫瘤的發生密切相關。基于當今世界腫瘤發生率和致死率逐年升高的現狀，研究TFAM 在各類腫瘤中的變化，有利于尋找潛在的生物標志用于預測腫瘤的發生及預后，也有利于尋找治療的潛在靶點，為腫瘤治療提供有價值的指標。目前TFAM對腫瘤產生影響的具體機制仍不清楚，所以腫瘤細胞中TFAM的分子功能值得深入探討。本文簡要概述近年來TFAM 對腫瘤細胞作用的研究進展，以期為腫瘤防治以及進一步藥物開發提供理論依據，為臨床治療提供新的理論視角。

1 TFAM的研究現狀

1.1 TFAM的結構

TFAM是線粒體最重要的調控因子之一，它參與mtDNA復制、轉錄以及拷貝數的調節[7]。TFAM基因位于10 號染色體長臂21 區(10q21)，編碼蛋白相對分子質量為25 000，是一種具有串聯高移動組(high mobility group，HMG)和結構域的DNA結合蛋白，在線粒體基因組的表達、維持和組織中具有核心作用，包含4 個結構域，依次為氨基端的HMG 結構域(HMG-box A)、鏈接區、HMG結構域(HMG-box B)和羧基端尾區[8]。

1.2 TFAM的生物學功能

1.2.1 TFAM 對mtDNA 復制和轉錄的影響線粒體生物生成的過程中，受到線粒體基因和核基因的共同編碼。TFAM 可以與mtDNA 結合，對mtDNA 的復制和轉錄進行調控。在轉錄起始時，TFAM 可以與人類線粒體基因組置換環(displacement loop，D-loop)區中的3個啟動子結合并彎曲DNA 的構象，由于構象的改變以及TFAM的羧基末端螺旋結構可以與線粒體RNA聚合酶(mitochondrial RNA polymerase，POLRMT)氨基延伸端的螺旋區域相互作用，因此TFAM可以將聚合酶招募并穩定在轉錄起始復合物中，從而促進mtDNA 的轉錄，影響mtDNA 轉錄起始和蛋白表達[9]。并且，TFAM 與mtDNA 模板的比例數目與轉錄活性的升高并不是完全呈線性關系。雖然mtDNA復制的基本機制中不涉及到TFAM，TFAM 還是會對mtDNA 的復制具有調控作用。

1.2.2 TFAM 對線粒體DNA 拷貝數的影響細胞內mtDNA 拷貝數的調控是復雜而精確的，但其調控的確切機制尚不清楚。Clay Montier 等[10]提出了上下閾值理論，即當mtDNA 拷貝數小于下閾值時，mtDNA 復制啟動，當mtDNA 拷貝數高于上閾值時，mtDNA 降解開始。TFAM 是mtDNA 拷貝數的重要調控因子。過度表達TFAM的小鼠在心臟、腎臟和骨骼肌中有較高的mtDNA 拷貝數[11]，而TFAM 表達的抑制會降低mtDNA 拷貝數。因此，TFAM可能參與了mtDNA拷貝數的調節。

1.2.3 TFAM 對線粒體功能的影響在人類細胞中，線粒體DNA環包含約16.6 kb的堿基以及37個基因，其中22個基因編碼轉運RNA，2個編碼核糖體RNA和13個負責組成氧化呼吸鏈復合體的蛋白質[12]。線粒體的主要功能之一是氧化磷酸化，這是產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要來源，一定范圍內的ROS對于細胞的正常增殖與分化十分必要，但過多則會造成損傷。由于mtDNA 的特殊性，使得它很容易受到ROS的攻擊，并且因mtDNA 的損傷修復機制與核DNA 不同，使得mtDNA的損傷更易保留，難以修復，長久的累積最終會產生氧化應激。據報道，過度表達TFAM會增加mtDNA拷貝數，抑制線粒體ROS 及其上調，促進與線粒體氧化應激有關的心臟保護[11]；在TFAM 的小鼠基因敲除模型中，細胞的氧化磷酸化受到損害，mtDNA的拷貝數降低，mtDNA氧化損傷的修復時間增加，小鼠的胚胎致死率明顯增加；對黑腹果蠅的研究也表明，TFAM 可以消除氧化應激并抑制線粒體的過度損傷；此外，研究表明ROS 的水平在抑制TFAM 表達的腫瘤細胞中明顯增加，一同上升的還有腫瘤細胞對化療藥物的敏感性以及細胞凋亡率[13]。在人體衰老過程中，mtDNA的突變積累誘發了呼吸鏈的功能障礙，導致了ROS產生的增強。因此，年齡依賴性的記憶損傷可能是由呼吸鏈產生的氧化壓力造成的。TFAM 轉基因(TFAM transgenic，TG)小鼠在與年齡相關的脂質過氧化產物積累方面有明顯改善，大腦中的復合物I 和IV 活性也有所降低，老齡化的TG 小鼠在運動記憶、工作記憶和海馬體長期記憶(long-term potentiation，LTP)方面的缺陷也得到明顯改善，推斷TFAM的過度表達可能通過防止小膠質細胞的氧化應激和線粒體功能障礙來改善與年齡相關的大腦功能退化[14]。TFAM 中含有HMG 結構域可以和DNA 中的磷酸骨架結合，增加線粒體DNA 的穩定性和完整性，從而保護mtDNA 不被ROS 降解，不難得出，TFAM 在維持線粒體功能，尤其是對氧化應激的清除以及降低相關疾病的發生方面具有重要意義。

2 TFAM與腫瘤

據國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)公布：2020 年全球新增1 930 萬癌癥患者，1 000萬人因癌癥去世。目前，全球每5個人中就有1人會在一生之中罹患癌癥，每8名男性和每11名女性之中，就有一人會因癌癥去世。癌癥防控是世界性難題，近年來，我國癌癥總體發病率和死亡率呈現逐年上升趨勢，癌癥已成為嚴重威脅我國居民健康的重大公共衛生問題。但美國癌癥研究協會(American Association for Cancer Research，AACR)關于整個癌癥治療領域的進展統計顯示，在過去一年中，橫跨癌癥治療的五大支柱——手術、放療、化療、分子靶向治療和免疫治療都取得了重大進展，正在挽救更多的癌癥患者并改善治療效果。由于腫瘤的發病原因復雜多樣，我們對于腫瘤的了解還不夠全面、深入。因此，關于腫瘤治療的研究仍需繼續，腫瘤問題依舊需要高度關注。

據研究，線粒體生物生成在腫瘤發生中起著重要作用[15]。線粒體生物發生由一組高度關聯成網的轉錄因子和調控因子所控制。

2.1 TFAM對腫瘤細胞生長增殖凋亡的影響

TFAM 在多種人類惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關。與癌旁組織相比，TFAM 在部分癌組織中表達顯著減少，改變線粒體DNA的拷貝數，并且其表達水平的高低與腫瘤患者預后也密切相關。隨著研究的深入，TFAM 如何對腫瘤產生影響的部分分子機制得到驗證。胃癌是常見的腫瘤之一，與生活結構、飲食方式密切相關，近年來有逐漸年輕化的趨勢。Lee 等[16]研究發現TFAM-mtDNA-calcium-CFAP65-PCK1 軸參與線粒體逆行信號傳導，影響腫瘤細胞分化和增殖。除此之外，有研究通過qRT-PCR、免疫組織化學法、Western blotting、熒光素酶活性分析實驗，以及進一步的細胞功能實驗，驗證miR-RNA 通過靶向TFAM 對皮膚鱗狀細胞癌[17]、乳腺癌[18]等腫瘤細胞的增殖及凋亡產生影響。并且，近些年探索腫瘤逃避NK 細胞殺傷的機制成為腫瘤免疫治療領域的研究熱點。Fan等[19]通過研究證明，TFAM表達下調誘導線粒體DNA 應激促進HLA-G 表達來抑制NK 細胞的活化以及殺傷。Yang等[20]利用TFAMflox/flox與villin-cre+/+的C57BL6/J小鼠雜交得到TFAM 腸道特異敲除小鼠(TFAMcko)，運用氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉聯合誘導的炎癥相關結直腸癌小鼠模型；采用慢病毒轉染的方式構建干涉和過表達人正常結腸上皮細胞NCM460中TFAM，并通過細胞周期和EdU 實驗檢測細胞增殖；利用共聚焦顯微鏡觀察NCM460細胞干涉TFAM 后mtDNA 應激形態；采用qPCR 和ELISA 等方式檢測結腸組織中炎性因子的表達情況，結果顯示炎性腸癌患者腸癌組織中的TFAM表達較正常對照結腸組織顯著下降，TFAM缺失介導的線粒體DNA作用于炎性小體活化caspase-1 促進炎性因子IL-1β、IL-18 表達，這為炎癥相關結直腸癌的發生及潛在生物學機制提供了依據。

2.2 TFAM對腫瘤細胞輻射敏感性的影響

近年來，由于放射治療在癌癥治療中的廣泛使用，輻射生物學領域的研究變得越來越重要。但臨床資料顯示，放療有一定發生失敗的概率以及有復發的可能性。并且，許多腫瘤細胞對射線的敏感性不高，存在著輻射劑量高、對正常組織副作用大以及腫瘤細胞放射抵抗等問題亟待解決。這提示我們要注意提高放療的靶向性、精確性。如今，放療與化療、基因治療以及免疫治療聯合的治療手段逐漸成為當今腫瘤治療研究的熱點。探究腫瘤細胞的輻射增敏機制，對于提高腫瘤治療效果有著指導性的意義[21]。

先前的研究證實，降低TFAM 表達可使腫瘤細胞對化療試劑和電離照射增敏。然而，潛在的機制在很大程度上仍然未知。Jiang等[22]發現TFAM表達的降低通過誘導G1/S期阻滯和降低E2F1、phospo-Rb、PCNA 和TK1 的表達來損害腫瘤細胞的增殖。此外，他們證明了敲除TFAM 可以增強p53 與MDM2 之間的相互作用，導致p53和下游靶點TIGAR的表達降低，從而導致線粒體超氧化物和DNA 雙鏈斷裂(double strand breaks，DSB)水平升高，而電離輻射處理細胞會加劇這兩種情況。這些結果表明，TFAM 的抑制可以通過影響線粒體衍生ROS 的產生來加劇輻射誘導的DSB水平。目前已提出了一種新的機制，即TFAM 通過p53/TIGAR 信號通路調節腫瘤細胞對電離輻射的敏感性。這表明TFAM可能是增加癌細胞對放療敏化的潛在靶點。

不止如此，Tang 等[23]證實了環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在輻照腫瘤細胞中增強TFAM表達的作用。實驗結果顯示，TFAM與COX-2在輻照腫瘤細胞中同時上調，COX-2衍生的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)增強了p38-MAPK 的激活，這進一步刺激了線粒體動力相關蛋白(dynamin-related protein 1，drp1)介導的TFAM的上調。并且，得出NS-398抑制COX-2可阻斷輻射誘導的TFAM表達，PGE2治療可刺激TFAM表達的結論。

2.3 TFAM對腫瘤細胞耐藥的調節作用

耐藥現象嚴重影響了腫瘤有效治愈率，如何提高藥物耐受性也是腫瘤界的新興研究熱點。越來越多的證據顯示，微核糖核酸(miRNAs)可能通過靶向TFAM 來增加敏感性。紫杉醇是一線化療藥物，具有耐藥現象。Yao 等[24]發現在乳腺癌細胞MCF-7 中，分別上調和下調miR-200a 的表達后聯合紫杉醇處理，利用MTT和BrdU檢測細胞生長的情況；同時，轉染TFAM過表達質粒后，單獨或聯合紫杉醇處理，檢測細胞增殖活力和DNA 合成能力變化。結果表明紫杉醇可通過miR-200a/TFAM通路調整其化療敏感性。

陳曦等[25]探討了miR-186-5p 在乳腺癌細胞5-Fu 化療敏感性中的作用，通過制備針對5-Fu 產生抗性的耐藥株(MCF-7/5-Fu)，對乳腺癌細胞MCF-7轉染miR-186-5p抑制劑，并對乳腺癌耐藥株MCF-7/5-Fu轉染miR-186-5p模擬物，經過熒光素酶報告實驗、qRT-PCR 和Western blot 等以及進一步的功能實驗，結果發現，上調乳腺癌耐藥細胞中miR-186-5p 的表達可有效逆轉細胞耐藥性。并且，結果顯示，miR-186-5p 與TFAM mRNA 3'-UTR區存在互補結合的序列，且miR-186-5p負調控TFAM的表達，由此推測，miR-186-5p可能通過靶向作用TFAM在乳腺癌細胞耐藥性中發揮調節作用。

此外，順鉑(cisplatin，DDP)是一種廣泛應用的化療藥物，Fan等[26]發現，TFAM可能是miR-199a的靶基因。敲除TFAM可以部分逆轉由miR-199a-3p 抑制誘導的MDA-MB-231 細胞的DDP 耐藥性，而TFAM 過表達可以部分恢復miR-199a-3p 誘導的MDA-MB-231/DDP 細胞對DDP 的化療敏感性。這些結果表明，miR-199a-3p 能夠通過抑制TFAM 的表達減弱乳腺癌細胞的順鉑抗性。

綜上所述，TFAM 可以作為腫瘤增敏中一個有前途的治療關鍵點。但TFAM在腫瘤治療中發揮作用的分子機制仍需進一步探索。

2.4 TFAM在腫瘤中的臨床意義和預后價值

20世紀以來，癌癥、心腦血管疾病等預后嚴重的疾病成為威脅人類健康的頑兇，促進了對預后多角度、多層面研究的普遍開展。預后研究有助于醫患雙方了解疾病的發展趨勢，并作出知情的臨床決策。

Gao 等[27]通過收集患者的乳腺癌組織和鄰近的正常組織，并對Nrf1 和TFAM 蛋白的表達進行了免疫組織化學陣列分析，研究結果表明，Nrf1 和TFAM 蛋白在不同類型的乳腺癌患者的癌細胞中表達增加，與陰性表達患者相比，Nrf1 和TFAM 陽性表達患者的臨床預后更差，生存時間更短。這些結果表明，Nrf1 和TFAM 是確定個體化治療和乳腺癌預后的潛在生物標志物。不僅如此，在食管鱗狀細胞癌[28]、肝癌[29]等癌癥中TFAM在癌細胞中表達增加也得到驗證。然而，并不是所有癌癥中均存在此現象。Katsuki 等[6]采用了類似的方法，收集了左側或右側結直腸癌(colorectal cancer，CRC)患者的癌組織，進行免疫組織化學染色，探討TFAM 表達與臨床病理因素及預后的關系。結果顯示，TFAM 表達與左側結直腸癌患者的淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期及淋巴浸潤均有顯著相關性，而與右側結直腸癌患者的任何因素均無明顯相關性。上述結果提示TFAM是左側CRC患者腫瘤進展和預后不良的有效標志物，但在右側CRC患者中不是。

這些結果表明，TFAM 的表達可能是確定個體化治療和腫瘤預后的有用參數，可以作為開發靶向治療的新目標，不過，腫瘤界需要進行更多的機制研究，以期進一步了解該基因的表達方式及其與細胞功能的關系。

3 展 望

惡性腫瘤發病率逐年上升，病因尚不清楚。TFAM 在多種人類惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關，作為腫瘤分子治療靶點和生物標志物是個較好的選擇。目前，關于TFAM如何在腫瘤中發揮作用，已經有部分猜想得到驗證，但仍舊缺乏更多的數據。本文為臨床研究腫瘤的發病機制，尋找診斷及判斷預后的標記物，以及探索新的精準治療靶點提供了參考依據。