Notch信號通路在卵巢癌中的研究進展

劉志彬，岳文濤

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院中心實驗室，北京 100026)

近年來卵巢癌患者死亡率高達5%[1]。如此高的致死率是因為其隱蔽性強、早期診斷難度大，70%以上的患者在被確診時已處于疾病晚期，錯過了最佳治療時機。雖然臨床放療、藥物治療等標準治療方法對患者病情有所緩解，但是60%以上晚期患者對一線抗癌藥物，如順鉑、紫杉醇等，容易產生耐藥性，患者5年生存率不足40%[2]。因此，有必要針對卵巢癌發展進程及耐藥分子機制進行深入、系統地研究，尋找有效診斷、治療靶點。

Notch 信號通路是一種傳遞細胞之間信號的通路，同時也是一種在進化上高度保守的信號通路。Notch 通過相鄰細胞之間的相互作用，廣泛參與多種細胞的增殖、分化、衰老以及凋亡等過程。研究表明，Notch 信號通路不僅在正常細胞中發揮重要的信息傳遞作用，還參與幾乎所有癌癥的發展進程[3]。但Notch 信號通路在癌癥生物學中的作用存在爭議，因為它已經被證明在多種類型的癌癥中發揮促癌和腫瘤抑制作用。這種不一致適用于甲狀腺癌、肝癌等多種癌癥，表明Notch 信號通路在癌癥中的功能依賴于其所處的細胞類型和微環境。近年來，越來越多的科學研究將Notch 信號通路與卵巢癌聯系起來。因此，闡明Notch 在卵巢癌發生發展中的重要作用，有助于了解卵巢癌的發病機制，并且為基于Notch 信號通路的腫瘤靶向治療提供重要的證據。

在此，本綜述簡要總結了正常Notch 信號通路的關鍵步驟和調節因子，然后歸納Notch 在卵巢癌中的作用及分子機制。對卵巢癌中Notch 信號通路的功能和機制理解越清晰，越有助于了解卵巢癌發生機制，同時可以幫助開發新的腫瘤診斷、治療策略，使患者獲益。

1 經典Notch信號通路簡介

Notch 信號通路最早是由美國學者Dexter 在黑腹果蠅中發現典型的缺口翅(notched-wing)突變表型[4]，3年后另一位美國學者Morgan 發現導致果蠅缺口翅突變表型的等位基因是Notch[5]。此后，越來越多的科學文獻發現Notch 在多細胞生物的發育過程中發揮重要作用。

Notch 信號通路主要組分包括配體、受體、激酶和靶基因。配體與受體的結合標志著Notch 信號通路激活，其具體活化過程如圖1所示，當Notch配體結合到受體的Notch胞外結構域(Notch extracellular domain，NECD)時，促進受體分解，經ADAM 金屬蛋白酶切割跨膜結構域外部S2 位點和γ分泌酶切割跨膜結構域胞內段S3 位點，使得Notch 胞內結構域(Notch intracellular domain，NICD)釋放到細胞質中，隨后進入細胞核；入核后的NICD 與輔助激活因子MAML(mastermind-like)、DNA 結合因子RBPJ(也稱為CSL)結合形成Notch 轉錄復合物，隨即Notch轉錄復合物與Notch調控元件結合后，招募轉錄輔助調節因子，激活下游靶基因轉錄[6]。

2 Notch信號通路關鍵分子表達

人體中主要包含4 種Notch 受體，即NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4，和5 種配體，即δ樣配體(delta-like ligand 1，DLL1)、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2。諸多證據表明Notch 信號通路配體/受體失調與癌癥相關。然而，關于Notch信號通路在卵巢癌中的報道較少。而且，Notch信號通路在卵巢癌中的作用似乎與Notch 受體/配體以及分析方法有關。已有研究人員針對Notch 信號通路中各配體和受體在卵巢癌中表達情況的分析，大多數是使用RT-PCR、免疫組織化學染色、Western blot 等技術，并且研究人員大多在卵巢癌患者的正常組織/卵巢癌組織，或者正常細胞系/卵巢癌細胞系中進行檢測。Notch 信號通路中多種配體和受體在不同的卵巢癌細胞系、卵巢癌組織中表達水平各不相同，且各具特色，具體表達情況見表1。

表1 Notch信號通路中多種信號分子在卵巢癌中的表達情況

Hopfer等[7]于2005年發表了第一篇關于Notch信號通路在卵巢癌中表達的文獻。文獻通過RT-PCR 方法，對17 例卵巢腺癌、3 例交界腫瘤和12 例腺瘤檢測發現Jagged2、DLL1、Manic Fringe、TSL 在卵巢腺癌中的表達頻率更高，而Deltex、Mastermind 在腺瘤中表達頻率更高。熒光定量PCR 檢測到Notch1 mRNA 在卵巢腺癌中的表達低于腺瘤，利用Western blot檢測Notch1、NECD在卵巢癌、交界腫瘤和腺瘤中的表達量相似，Notch1 下游靶蛋白HES1 在卵巢癌和交界腫瘤中表達量高于腺瘤，然而在卵巢腺癌和表面上皮細胞系中，HESl蛋白的表達水平相似，均較高。再者，Wang 等[17]利用免疫組織化學、Western blot和RT-PCR技術，在109例卵巢癌組織、65例對側患者正常卵巢組織、48 例正常卵巢組織和卵巢癌細胞系檢測Notch1表達。他們發現Notch1在卵巢癌組織的表達量明顯高于匹配的正常卵巢組織，同時，Notch1 在卵巢癌細胞系A2780、HO-8910中高表達，而且Notch1的表達隨著卵巢癌組織的分化不良和FIGO 分期的增加而逐漸增加。可見，對于同一因子，在不同的腫瘤組織中的表達水平是不同的。卵巢癌原發腫瘤中NICD的高表達是總生存率的一個獨立不良預后因素[18]。除了以上的實驗檢測，研究人員也進行了大數據分析。Defreitas 等[13]利用生物信息學方法分析CSIOVDB、PRECOG、GENT和CCLE多種數據庫，系統地揭示了NOTCH2、NOTCH3和MAML1在卵巢癌中高表達，且對患者整體生存期至關重要。此外，Choi等[8]發現Jagged1是卵巢腫瘤細胞以及與擴散的卵巢癌細胞直接接觸的腹膜間皮細胞中表達最高的Notch 配體。免疫組化檢測Jagged1、Notch3 在60 例高級別漿液性卵巢癌中高表達。綜合以上的實驗檢測和生物信息學分析，我們發現有關Notch 信號通路中其他組分表達情況的文獻不多，并且結論存在相互矛盾，因此需要更多實驗數據才能得出結論。

綜上，Notch1-3、Jagged1 和Hes1 等在惡性程度高的卵巢癌中表達更高，卵巢癌中Notch 信號通路組分蛋白的表達上調，伴隨總生存期和無病生存期縮短，尤其是在晚期腫瘤患者中。因此，推測Notch 可以作為不良預后的標志。隨著科學技術的不斷發展，相信不久的將來，我們能在單細胞水平解析卵巢癌發展的多個進展時期各種細胞類型的變化情況，也能夠解析癌癥進展到不同時期Notch 信號通路在何種細胞有何等水平的表達，有望從分子水平、單細胞層面探究卵巢癌細胞發生發展的分子機制和耐藥機制。

3 Notch在卵巢癌中作為促癌信號通路

3.1 Notch配體的促癌作用機制

卵巢癌中，針對Notch 信號通路配體的研究主要聚焦在Jagged1、Jagged2、DLL4，且對卵巢癌增殖、侵襲、遷移以及上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等過程起促進作用。研究證實，過表達Jagged1 可以促進卵巢癌增殖、侵襲、遷移和腫瘤形成，同時增強卵巢癌細胞順鉑耐藥性[8-9]；機制研究指出Gata1可以結合到Jagged1啟動子區直接發揮作用，調控卵巢癌增殖、遷移等過程[9]。相反的，敲低Jagged1 抑制卵巢癌細胞增殖和順鉑耐藥細胞的EMT 過程，以及對腫瘤臨近細胞的黏附和生長作用[8，11]。并且，Jagged1除與Notch3互相作用影響卵巢癌增殖之外，Jagged1也可與STAT3直接結合，作用于卵巢癌侵襲和遷移等過程[11]。類似地，敲低Jagged2同樣能夠抑制順鉑耐藥卵巢癌細胞的EMT過程[11]；在中性粒細胞中敲低Jagged2，則能干擾T細胞的免疫活性[19]。另有臨床前研究指出，表達Jag和Delta的小血管附近的卵巢腫瘤細胞中優先發生Notch 激活現象，而且通過抗體阻斷基質細胞中的DLL4能夠有效抑制卵巢癌，尤其是通過抗體聯合阻斷DLL4和血管內皮生長因子VEGF，可明顯增強靶向DLL4的抗腫瘤作用[20]。此外，研究者在人的卵巢癌組織中檢測到DLL1、DLL3表達，但是DLL1、DLL3在卵巢癌中的具體作用尚待研究。

3.2 Notch受體的促癌作用機制

Notch 受體與配體的促癌功能表型一致。過表達Notch1 能夠促進卵巢癌的增殖能力、EMT 和遷移，并且機制研究發現Notch 和TGFβ形成了一個相互的正向調控回路發揮功能[7，21]。可見，Notch 信號通路調控卵巢癌的增殖、遷移和EMT 過程不是獨立的，需要其他信號通路的協助作用。此外，Park 等[22]通過單核苷酸多態陣列技術發現Notch3 在卵巢癌組織中DNA 拷貝數增多，Notch3功能敲低后，導致卵巢癌細胞增殖減少、凋亡增加。這預示著Notch3拷貝數增多，影響患者不良預后。通過機制研究發現，Notch3下游直接靶標為Pbx1，Notch3/CSL蛋白復合物能夠直接結合到Pbx1 啟動子區域，促進Pbx1 轉錄，而且過表達Pbx1 可以部分恢復因Notch 抑制劑GSI 引發的卵巢癌細胞增殖抑制現象[14]。由此，可以看出Notch 信號通路也可以獨立調控卵巢癌的發展進程。隨后，研究人員發現Notch3不僅影響卵巢癌細胞的發展，也影響腫瘤干細胞及其對藥物的敏感性。McAuliffe 等[23]發現在腫瘤細胞中過表達Notch3，可以增強卵巢腫瘤干細胞的擴增和鉑類耐藥性，敲低Notch3能夠降低腫瘤干細胞擴增能力、增強卵巢腫瘤細胞對鉑類藥物的敏感性。除此之外，Kang等[15]在紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞系(SKpac)中，利用siRNA 敲低Notch3，同樣發現抑制Notch 信號通路能夠增強紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞對紫杉醇藥物的敏感性。另外，在經順鉑治療的卵巢癌細胞系中過表達Notch 下游靶基因Hes1，將增強腫瘤干細胞的成瘤性、干性和順鉑耐藥性[24]。這再次證明了Notch 信號通路影響卵巢腫瘤細胞對抗癌藥物的敏感性，進而影響卵巢癌患者的治療效果。由此可見，Notch 受體在卵巢癌中起促癌作用，同時還影響腫瘤細胞對藥物的耐藥性。在腫瘤細胞中，不同的Notch 受體是同時對腫瘤細胞發揮作用還是獨立影響，以及受體之間的網絡調控關系，需要后續研究驗證。

3.3 Notch信號通路抑制劑的臨床前研究現狀

目前Notch 抑制劑作為抗癌藥物被廣泛研究[25]，靶向Notch作為卵巢癌的新治療策略尚處于臨床前階段，未轉化為Notch抑制劑與常規療法相結合的臨床試驗。DAPT能夠抑制Notch信號通路活性，可以有效抑制卵巢癌細胞增殖，使細胞周期停滯在G1期，明顯促進細胞凋亡[12]。同時，DAPT 也能抑制鉑耐藥卵巢癌細胞系的增殖、遷移、侵襲和EMT過程[11]。γ-分泌酶抑制劑(GSI)是另一種Notch 信號通路抑制劑，順鉑/GSI 聯合療法通過增強DNA 損傷反應、G2/M 細胞周期停滯和細胞凋亡，對Notch 依賴性腫瘤細胞具有協同細胞毒作用[23]。Notch 抑制劑作為新的診斷、治療靶點，仍然需要探索。

3.4 Notch信號通路上游調控因子的研究現狀

卵巢癌中Notch信號通路異常激活可以通過Notch抑制劑阻斷，還可以考慮通過其上游因子調控。在卵巢癌中，關于Notch 信號通路上游因子的文章報道有限。上游因子作用于Notch 信號通路的分子機制尚不完全清楚。例如糖基轉移酶GnT-III、LnRNA 類固醇受體激活物(steroid receptor activator，SRA)和黃腐酚。糖基轉移酶GnT-III 在上皮性卵巢癌中缺陷能夠抑制Notch1由溶酶體外轉入溶酶體內，該研究說明了二等分糖基化可調控Notch信號通路轉導[26]。而LnRNA SRA介導卵巢癌增殖、遷移、侵襲，并且體內和體外的實驗證明其影響EMT和Notch 信號通路相關蛋白的表達[27]。此外，黃腐酚具有抑制芳香化酶(睪丸酮轉化成雌激素)的活性，研究證實黃腐酚能夠明顯抑制Notch1表達，同時抑制卵巢癌細胞系增殖，促進細胞凋亡，并破壞細胞周期[28]。因此，通過控制上游因子干預Notch信號通路異常激活是一種很有吸引力的潛在策略，同時也需要基礎研究不斷探索。

總之，Notch 信號通路不僅參與卵巢癌的發生、發展，還參與卵巢癌的化學耐藥。但是，Notch 信號通路與卵巢癌之間的細微關系仍未闡明，需要更多的基礎和臨床研究者進一步深入研究。

4 展 望

雖然，Notch 信號通路在卵巢癌中的作用還未被完全揭示，Notch 信號通路在卵巢癌中作用的因果關系仍不明朗，但是從目前的研究我們仍可以看出Notch 信號通路對卵巢癌發生發展、耐藥性起到正向的調節作用，作用方式可以是細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等，同時也需要其他信號通路的協助，如TGFβ信號、PI3K/AKT 等。鑒于Notch 信號通路在其他癌種、生物體正常發育過程中均發揮重要作用，而且在正常細胞和腫瘤細胞中作用不同，提示我們確定Notch 信號通路在卵巢癌中的作用，不能單純通過其他細胞類型的研究進行推斷，仍然需要研究者深入、細致地探究Notch 信號通路在卵巢癌中的具體分子作用機制和耐藥機制。或許這將為卵巢癌的早期診斷開發新的生物標志物，指導Notch 信號通路抑制劑進行臨床試驗。結合日趨完善的生物學技術，如時空特異性、單細胞測序、大數據分析等，即使Notch 信號通路由于其自身作用的復雜性，不能直接作為用藥或者治療的分子靶標，由其引申的下游效應因子、靶向抑制劑等，或有望個性化地診斷和治療卵巢癌。