DNAJB4與非小細胞肺癌免疫細胞浸潤和患者預后的相關性分析

楊上英，黃明翔，許德新，劉加夫，陳新富

(1.福建省福州肺科醫院檢驗科，福建 福州 350008；2.福建省福州肺科醫院胸外科，福建福州 350008；3.福建省福州肺科醫院病理科，福建 福州 350008；4.福建醫科大學臨床教學醫院檢驗科，福建 福州 350008)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是臨床上肺癌最常見的病理類型，約占85%左右。盡管手術是早期NSCLC 的首選治療方法，但是Ⅰ～ⅢA期患者5年生存率僅為14%～49%，ⅢB～Ⅳ期患者的生存率不到5%[1]。隨著免疫治療在晚期NSCLC治療中的應用，腫瘤生存的微環境是目前研究的方向。微環境中的免疫細胞與NSCLC的發生發展關系密切，在免疫調節中發揮重要作用[2]，相關免疫細胞的浸潤程度對NSCLC患者的診治及預后評估價值顯著[3]。

DnaJ 熱休克蛋白家族(Hsp40)成員B4[DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member B4，DNAJB4]是DNAJ/Hsp40 家族的成員，也稱人肝臟DnaJ-like 蛋白(human liver DnaJ-like protein，HLJ1)，在調節蛋白質折疊和活性方面起著重要作用。DNAJB4 是一種新發現的腫瘤抑制因子，與腫瘤發生和轉移有關。研究證實，DNAJB4在肝癌[4]、結腸癌[5]、乳腺癌[6]等多種腫瘤組織中低表達。然而DNAJB4 在NSCLC 發生發展中的作用以及潛在生物學機制尚不清楚，并且DNAJB4 與免疫細胞浸潤及患者預后的關系未見報道。人類基因組數據庫的建立給NSCLC的發生、發展及潛在的分子機制研究指明了方向。本研究通過實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)、免疫組織化學及多個生物學信息數據庫分析DNAJB4基因在NSCLC 中的表達及其與免疫細胞浸潤和患者預后的關系，為NSCLC進展機制、治療及預后的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病例標本本研究經福建省福州肺科醫院倫理委員會審核批準后(2018-006-01)，收集2017年8月—2017年12月胸外科術前未接受放、化療及生物治療并經手術切除的45例NSCLC患者，手術獲取腫瘤組織及癌旁正常肺組織標本，分別進行qPCR和免疫組織化學檢測。

1.1.2 主要試劑EASYspin 組織/細胞RNA 快速提取試劑盒、HiScript Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ SYBR color qPCR Master Mix 均購自Vazyme 公司。DAB 染色液試劑盒、山羊抗兔IgG 均購自福州邁新生物科技開發有限公司。兔抗DNAJB4 單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。本研究采用美國Applied Biosystems 9700 PCR System進行qPCR反應。

1.2 方 法

1.2.1 GEPIA 數據庫分析基因表達譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn)是用于癌癥和正?；虮磉_譜和交互式分析的數據庫，提供交互和自定義功能，包括差異表達分析、圖譜繪制、相關分析、相似基因檢測、降維分析等[7]。本研究運用GEPIA 數據庫分析NSCLC 患者癌組織和癌旁正常組織中DNAJB4基因的表達差異。

1.2.2 RNA 提取和qPCR 檢測根據EASYspin 組織/細胞RNA快速提取試劑盒操作說明提取RNA。以提取的RNA 為模板，按逆轉錄試劑盒說明書反轉錄得到cDNA， 在實時定量PCR 儀上進行PCR 擴增。DNAJB4 mRNA 的引物序列：正向5'-GACGAATGGG TGGTGGTAGAG-3'，反向5'-GGAGGATCTTGTTTGA GGCG-3'。內參GAPDH 引物序列：正向5'-TGCACC ACCAACTGCTTAGC-3'，反向5'-GGCATGGACTGTG GTCATGAG-3'。PCR 反應體系包括AceQ qPCR SYBR Green 混合物10 μL，PCR 上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，PCR 下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，Rox 參比染料Ⅱ(50×) 0.4 μL，cDNA 模板1.0 μL，ddH2O(滅菌蒸餾水)加至20 μL。反應條件：94 ℃、30 s；94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個循環。采用SYBR 染料法測定DNAJB4的CT值，以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCT計算癌組織及癌旁正常肺組織中DNAJB4 mRNA 的相對表達水平，實驗重復3次，并取平均值進行統計。

1.2.3 免疫組化SP 兩步法檢測DNAJB4 蛋白的表達參照DAB染色液試劑盒說明書進行，切取4 μm的石蠟切片，60 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟和乙醇梯度水化后，用微波爐進行抗原修復。PBS沖洗，3%過氧化氫溶液室溫孵育封閉10 min。PBS 沖洗，加入1∶50 稀釋的抗DNAJB4蛋白抗體100 μL，于4 ℃冰箱內過夜孵育。PBS 沖洗，滴加二抗100 μL 室溫孵育30 min。PBS 沖洗，DAB 顯色5 min。自來水沖洗，蘇木素復染10～30 s，PBS 沖洗返藍。乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下閱片，拍照。

1.2.4 染色結果判定采用雙人盲法閱片，即由2位資深病理醫師，均在不知具體臨床資料的前提下，獨自判斷所得。在400 倍顯微鏡下隨機選取5 個視野，每個視野計數200 個腫瘤細胞，記錄陽性細胞百分比，DNAJB4 陽性細胞表現為細胞漿出現彌漫性棕黃色或棕褐色顆粒。DNAJB4 蛋白表達判定標準：①按染色強度評分。未著色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2分，棕褐色3 分。②按染色細胞百分率評分。陽性細胞＜5%記0 分，[5%，25%)記1 分，[25%，50%)記2分，[50%，75%)記3分，陽性細胞≥75%記為4分；將兩項評分結果相乘，＜2 分為DNAJB4 蛋白表達陰性，≥2分為DNAJB4蛋白表達陽性。

1.2.5 TIMER 數據庫分析TIMER 數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)通過TIMER算法估計6種免疫浸潤(B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)的豐度，為用戶提供可靠的免疫浸潤水平[8]，具有全面分析和可視化功能。采用TIMER 的GENE 模塊分析DNAJB4基因表達與免疫細胞類型以及腫瘤純度的相關性，SURVIVAL 模塊探討免疫細胞浸潤對NSCLC 患者預后的影響，SCNA 模塊進行DNAJB4 不同體細胞拷貝數變異的免疫細胞豐度比較。

1.2.6 評估DNAJB 在NSCLC 中的預后價值通過Kaplan-Meier plotter 數據庫(http://www.kmplot.com/analysis/)分析DNAJB4與NSCLC患者預后生存的關系。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，配對t檢驗比較DNAJB4基因在NSCLC 組織與正常組織中的表達差異，Graphpad Prism 5.0 繪圖；χ2檢驗比較DNAJB4蛋白在NSCLC 組織與正常組織中的表達差異。采用Wilcoxon 秩和檢驗分析DNAJB4 表達、拷貝數變異與免疫細胞浸潤水平的相關性，采用Kaplan-Meier 生存曲線分析DNAJB4 和免疫細胞浸潤對NSCLC 患者預后的影響。以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 DNAJB4基因在NSCLC組織中的表達水平

采用GEPIA 數據庫分析DNAJB4基因的表達水平，結果見圖1。在肺腺癌(腫瘤組織483 例，正常組織347 例)中，DNAJB4基因的表達水平低于正常組織，差異具有統計學意義(P＜0.05)；在肺鱗癌(腫瘤組織486例，正常組織338例)中，DNAJB4基因的表達水平亦低于正常肺組織(P＜0.05)。

圖1 GEPIA數據庫分析DNAJB4基因在NSCLC組織中的表達水平

qPCR 檢測結果見圖2。DNAJB4 mRNA 在NSCLC組織中的相對表達水平(0.51±0.35)顯著低于癌旁正常組織(1.14±0.68，P＜0.01)。免疫組織化學檢測結果見圖3，可見DNAJB4 蛋白在NSCLC 組織中的陽性率(26.67%，12/45)顯著低于癌旁正常組織(82.22%，37/45)，差異有統計學意義(χ2=27.998，P＜0.01)。

圖2 qPCR檢測DNAJB4 mRNA在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達

圖3 不同肺組織中DNAJB4蛋白的表達

2.2 NSCLC 中DNAJB4 的表達與6 種免疫細胞浸潤的相關分析

TIMER分析結果見圖4。DNAJB4的表達與癌組織中B 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞的數量均明顯相關(均為P＜0.01)?？梢姡珼NAJB4 在NSCLC 的免疫細胞浸潤中起重要作用。

圖4 DNAJB4的表達與免疫細胞浸潤水平的相關性

免疫細胞對NSCLC患者預后影響的分析發現，在肺腺癌中，B細胞高浸潤水平的肺腺癌患者存活時間較長(Log-rankP＜0.01)，預后較好。樹突狀細胞不同浸潤水平的兩組患者比較P值接近于0.05(Log-rankP=0.048)，差異無統計學意義，見圖5。其中低浸潤水平B 細胞是肺腺癌不良預后的獨立危險因素(P＜0.05)，如表1。在肺鱗癌中，免疫細胞浸潤對肺鱗癌患者預后無明顯影響，見圖5和表1。

表1 肺腺癌和肺鱗癌患者預后的多因素Cox回歸分析結果

圖5 免疫細胞浸潤對NSCLC患者臨床預后的影響

本實驗又發現，在肺腺癌中不同細胞的DNAJB4基因拷貝數變異對免疫細胞的浸潤水平均有影響，肺鱗癌中DNAJB4基因拷貝數變異對除CD8+T 細胞外的免疫細胞浸潤水平均有影響(圖6)，表明DNAJB4 在NSCLC 免疫細胞浸潤過程中發生一系列的生物學變化。

圖6 不同體細胞的DNAJB4基因拷貝數變異對免疫細胞浸潤水平的影響

2.3 DNAJB4基因在NSCLC中的預后價值

生存分析結果見圖7，顯示DNAJB4基因的表達水平與NSCLC 患者的總生存率[HR=0.76，95%CI(0.64，0.90)，P=0.001 7]顯著相關，而與NSCLC 患者的無病生存率[HR=1.02，95%CI(0.86，1.21)，P=0.78]、后期生存率[HR=0.95，95%CI(0.84，1.07)，P=0.39]無明顯相關關系。

圖7 DNAJB4基因不同表達水平NSCLC患者的生存曲線分析

3 討 論

DNAJB4基因的異常表達在細胞增殖、運動、侵襲、腫瘤發生和轉移過程中發揮著重要作用[9-10]。DNAJB4 作為熱休克蛋白家族成員，其表達和活性在細胞應激期間增加，可抑制多種癌癥類型的轉移和進展[11]。由于E-鈣黏蛋白是抑制腫瘤侵襲的重要元素，DNAJB4 專門從突變的E-鈣黏蛋白中識別野生型，因此DNAJB4 的作用是抑制腫瘤侵襲，但其抑癌機制尚不完全清楚。據報道，DNAJB4參與了STAT/p21WAF1信號過程，通過上調STAT/p21WAF1 的表達以及下調CyclinD1 的表達減緩細胞分裂和腫瘤細胞的生長，還有研究顯示CircRNA 0009043 可通過靶向miR-148a-3p/DNAJB4 軸抑制NSCLC 的發展[12]。這些研究發現，DNAJB4 通過某系列的信號通路發揮其特定的抑癌機制，調控NSCLC的進展。

最新發現，DNAJB4通過激活Hippo信號通路促進三陰性乳腺癌細胞凋亡，在乳腺癌細胞和組織中均低表達，且與預后不良相關[13]。DNAJB4通過減少基質金屬蛋白酶2 和9(MMP-2 和MMP-9)的表達和活性來抑制黑色素瘤細胞的侵襲，且低水平DNAJB4 的患者預后較差[14]。在本研究中，我們發現DNAJB4 在NSCLC組織中低表達，提示DNAJB4 影響NSCLC 的增殖和轉移等生物學現象，在NSCLC 發生發展過程中發揮其作用。

目前，腫瘤微環境及免疫靶向治療是NSCLC的研究熱點。微環境中的免疫狀態對腫瘤的發生發展及預后判斷有著十分重要的意義[15]。研究表明，腫瘤微環境中的免疫細胞是腫瘤免疫治療的決定性因素，而且免疫細胞浸潤水平對患者預后判斷具有重要的參考價值。本研究進一步分析了DNAJB4 表達與NSCLC 組織免疫微環境的關系，結果發現DNAJB4基因與多種免疫細胞(B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)浸潤水平相關，表明DNAJB4 參與NSCLC 細胞的免疫浸潤過程，在免疫浸潤中起重要作用。再者我們又發現DNAJB4基因拷貝數變異影響了免疫細胞的浸潤水平，表明了DNAJB4基因的多態性與免疫細胞發生發展密切相關，DNAJB4 參與NSCLC 中腫瘤細胞和免疫細胞之間的作用機制，調控NSCLC的進展。

有證據表明，B 細胞是各種實體瘤中浸潤性免疫細胞的關鍵成分，幾乎占浸潤性淋巴細胞總數的一半[16-17]。然而B 淋巴細胞在腫瘤免疫中既發揮促癌作用，又發揮抗癌作用。我們的研究發現，在LUAD中，B 細胞的浸潤水平與DNAJB4基因表達及患者生存顯著相關，而且多因素Cox 回歸分析顯示低浸潤水平B細胞與LUAD 患者更短的OS期相關。這說明B細胞浸潤影響LUAD 患者的生存，而DNAJB4基因參與了LUAD免疫細胞浸潤的調控，B細胞可作為LUAD不良預后的獨立因素。

本研究進一步探討了DNAJB4基因的表達與NSCLC 患者的預后，結果顯示DNAJB4基因的低表達只與NSCLC 患者的總生存期(OS)顯著相關。從圖7 可以看出高表達水平DNAJB4 的NSCLC 患者生存時間長于低表達水平DNAJB4的患者，提示如果上調DNAJB4基因表達將延長NSCLC患者的生存時間，這將為我們后續的DNAJB4 在NSCLC 中相關調控機制提供了新的思路和方向。

綜上所述，本研究發現DNAJB4 在NSCLC 組織中表達下調，參與NSCLC 免疫細胞浸潤的過程，且與NSCLC 患者的不良預后相關。特別是，DNAJB4基因的表達與B 淋巴細胞浸潤水平相關，B 細胞浸潤水平是LUAD 患者的預后判斷因素。DNAJB4 在NSCLC 免疫細胞浸潤中發揮重要作用，可作為一種潛在的免疫細胞浸潤及預后的生物學標志物，也可為后續NSCLC免疫治療和靶向治療提供參考。