血清miRNA-183與CA199聯合檢測在胃癌診斷和預后評估中的價值

何廣思，魏 潔，張 健

(安徽醫科大學附屬滁州醫院/滁州市第一人民醫院腫瘤科，安徽 滁州 239001)

胃癌(gastic cancer，GC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率居消化道惡性腫瘤之首[1]。大多數胃癌患者在確診時已處于疾病晚期，治療效果極差。目前臨床中常用于胃癌診斷的腫瘤標記物有糖類抗原199(carbohydrate antigen 199，CA199)、CA724、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等，但由于它們的特異度和靈敏度較低，導致其臨床價值不高[2-4]。因此，尋找具有高靈敏度和高特異性的腫瘤標志物對胃癌的診斷及治療有重要的意義。

miRNA是一種非編碼單鏈RNA，通過與靶基因的非編碼區結合來控制轉錄后的基因表達。相關研究[5]表明，由于不同腫瘤患者循環血中miRNAs 的表達存在差異，而且這種差異具有組織特異性和穩定性，因此呈現差異表達的miRNAs 有望成為新的生物標記物。但目前血清miRNA-183在胃癌中的診斷價值尚不明確。本研究采用逆轉錄實時熒光定量PCR(reverse transcription quantitative real ting-PCR，RT-qPCR)檢測胃癌患者血清中miRNA-183 水平，探討miRNA-183 聯合CA199 檢測在胃癌的診斷和預后評估中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2021年12月在安徽醫科大學附屬滁州醫院經由胃鏡診斷的52 例胃癌患者納入胃癌組，其中42例接受根治性手術，并經手術病理再次明確診斷。胃癌患者年齡36～79 歲，中位年齡為64 歲；男性29人，女性23人；腫瘤組織學分級為中-高分化20 例，低-未 分 化32 例；TNM 分 期I～II 期17 例，III～IV 期35 例；無淋巴轉移8 例(N0)，有淋巴轉移44例(N1～N3)；遠處轉移9例(M1)。選取同期本院胃鏡診斷為胃部良性病變患者40例納入對照組，其中萎縮性胃炎8 例，慢性淺表性胃炎21 例，胃息肉3 例，胃潰瘍8 例。對照組人群年齡40～72 歲，中位年齡61 歲；男22 人，女18 人。納入條件：所有胃癌患者均經病理學診斷，根據美國腫瘤聯盟(AJCC)TNM(第7版)進行分期。所有病人在取血標本之前均未接受手術、放療、化療等其他治療。排除合并有其他惡性腫瘤、肝腎功能異常等情況。本研究經安徽醫科大學附屬滁州醫院的倫理學委員會審核通過(編號2021xkj205)，并經過全體受試者的知情同意和簽字。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol LS 試劑和PCR 引物購自美國Invitrogen 公司，引物序列為：miRNA-183 上游，5'-CGGCAGTT CACAGTGGCTAA-3'，下游，5'-CAGAGCAGGGTCC GAGGTA-3'；內參U6 上游，5'-GTCGGGTCCAGAG CAGGG-3'，下游，5'-CACGTTCGCTCTGGACCCG-3'。RR047A 型反轉錄試劑盒和9753A 型miRNA 提取試劑盒均購自日本TaKaRa公司；CA199檢測試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司。7900型PCR擴增儀購自美國ABI 公司，Architect ci8200SR 自動免疫分析儀購自美國雅培公司。

1.3 方 法

1.3.1 收集血清樣本采集受試者外周靜脈血5 mL于無RNA 試管中，以3 000 r/min 的速度離心10 min，然后靜置凝固0.5～1 h。將1.5 mL 上清液儲存在-80 ℃備用。所有樣品必須在采集后2個月內使用。

1.3.2 RT-qPCR 檢測miRNA-183 的表達利用RT-qPCR 進行miRNA-183 的表達檢測。采用miRNA提取試劑盒提取血清miRNA，通過反轉錄試劑盒將提取的miRNA 反轉錄生成cDNA，利用qPCR 擴增進行miRNA-183的表達檢測。反應體系共20 μL，其中包括TaqMan Micro RNA Assay 1.00 μL，cDNA 1.33 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。擴增條件：93 ℃預變性10 min，93 ℃變性32 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸34 s，45 個循環。應用熒光定量PCR儀自帶軟件分析結果，采用2-ΔΔCT法對miRNA-183相對表達水平進行計算。

1.3.3 CA199 檢測采用Architect ci8200SR 自動免疫分析儀及CA199檢測試劑盒通過化學發光免疫分析檢測CA199。根據儀器的操作指南，可以導出和分析所需的CA199濃度數據。

1.4 隨訪及生存分析

通過門診電子病歷結合電話進行隨訪，每3 個月隨訪1 次，截至2022 年12 月31 日。總生存期(overall survival，OS)定義為從手術之日到患者死亡或隨訪截止日期的時間。

1.5 統計學處理

利用SPSS 21.0 軟件進行數據處理，滿足正態分布，方差齊性的計量資料采用±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組比較采用方差分析，非正態分布的計量資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以率或例數表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線，對miRNA-183、CA199 的診斷效能ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)進行分析。采用Kaplan-Meier 法進行生存曲線分析，以對數秩檢驗(log-rank test)計算生存曲線間的差異。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 miRNA-183 在胃癌患者及健康人群血清中的表達水平

RT-qPCR 結果顯示，對照組血清中miRNA-183的相對表達量為3.61±1.89，胃癌組為4.59±1.63，胃癌組的miRNA-183表達水平明顯高于對照組(P＜0.01)。

2.2 miRNA-183與CA199的表達水平與胃癌患者臨床病理指標的關系

根據患者性別、年齡、原發灶部位、組織學類型、T 分期、TNM 分期和淋巴結是否發生轉移等進行分組統計分析。結果顯示，組織病理分型為低-未分化、T3～T4 期以及TNM 分期為III～IV 期患者血清中miRNA-183 的表達水平分別顯著高于中-高分化類型、T1～T2 和TNM 分期為I～II 期的患者，差異均具有統計學意義(均為P＜0.01)。而不同年齡、性別、原發灶部位、淋巴結轉移的患者血清中miRNA-183表達水平的差異均無統計學意義(均為P＞0.05)。組織病理分型為低-未分化、TNM 分期為III～IV 期患者CA199 水平分別顯著高于中-高分化、TNM 分期為I～II 期的患者，差異具有統計學意義(均為P＜0.01)。而不同年齡、性別、原發灶部位、T 分期、淋巴結轉移的患者血清中CA199 表達水平的差異均無統計學意義(均為P＞0.05)，見表1。

表1 miRNA-183與CA199表達水平與胃癌患者臨床病理指標的關系

2.3 miRNA-183 聯合CA199 診斷胃癌的ROC 曲線分析

在約登指數最大值時miRNA-183 相對表達量為4.11，其診斷胃癌的敏感度及特異度分別為67.31%和80%，AUC 為0.771，95%置信區間為(0.672，0.853)，P＜0.05；在約登指數最大值時CA199 的相對表達量為46.17 U/mL，其診斷胃癌的敏感度及特異度分別為53.8%和87.5%，AUC 為0.724，95%置信區間為(0.621，0.812)，P＜0.05。聯合檢測血清miRNA-183與CA199診斷胃癌對應的敏感度及特異度分別為76.92%和87.5%，AUC 為0.882，95%置信區間為(0.798，0.940)，P＜0.05。miRNA-183 聯合CA199 診斷胃癌的AUC大于miRNA-183、CA199獨立診斷。見圖1。

圖1 血清miRNA-183、CA199診斷胃癌的ROC曲線

2.4 生存分析

根據胃癌患者血清中miRNA-183 的最佳臨界值4.11，52例胃癌患者被分為miRNA-183高表達組和低表達組。Kaplan-Meier 分析顯示，miRNA-183 高表達組患者的OS 為(34.504±2.897)個月，低表達組患者的OS為(47.408±3.057)個月，兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。根據胃癌患者血清中CA199 水平的最佳臨界值，選取miRNA-183和CA199均高表達的胃癌患者為雙高表達組，其余患者為非雙高表達組，Kaplan-Meier 分析顯示，雙高表達組患者的OS 為(31.344±3.377)個月，非雙高表達組患者的OS 為(45.725±2.876) 個月，雙高表達組患者的OS 明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 血清中miRNA-183和CA199表達水平與胃癌患者總生存率的關系

3 討 論

近年來，鑒于miRNAs的獨特性，miRNAs作為惡性腫瘤生物標志物的研究不斷深入。研究[6-8]表明，腫瘤發生發展過程中miRNAs 發揮著重要作用，有成為腫瘤篩查的生物學標記物及靶向治療靶點的可能，尤其是與傳統的腫瘤標記物聯合檢測已成為腫瘤診斷、療效及預后預測的重要手段之一。miRNA-183家族是一組重要的調控基因，在腫瘤發生和發展過程中扮演著關鍵的角色。miRNA-183 家族由miRNA-183、miRNA-96 和miRNA-182 組成，它們的基因位于人類7 號染色體。研究發現：在宮頸癌、腎透明細胞癌等多種腫瘤中miRNA-183的表達水平被發現有不同程度的降低[9-10]。這一發現引發了對miRNA-183 在腫瘤抑制中潛在作用的關注。然而，近來的研究也發現，在某些腫瘤類型中，如舌癌、間皮瘤等，miRNA-183卻顯示出促癌效應[11-12]。這種矛盾的結果表明，miRNA-183 在不同腫瘤中可能具有不同的作用機制，這一差異主要取決于其所調控的下游基因的不同。miRNA-183 通過與特定的下游基因相互作用，可以對細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學過程進行調控。Lin等[13]研究表明miRNA-183作腫瘤相關的miRNA參與調節胃癌細胞的遷移和侵襲。王婭南等[14]研究結果提示胃癌患者腫瘤組織和胃癌細胞株中miRNA-183-5P 水平顯著降低，說明了miRNA-183在胃癌的發生發展中發揮重要作用。

本研究發現，胃癌患者血清miRNA-183水平顯著高于胃部良性疾病患者。進一步分析miRNA-183表達水平與胃癌患者臨床病理指標之間的關系，結果顯示：低-未分化組織學類型、T3～T4 期以及TNM 分期為III～IV期患者癌組織中miRNA-183的表達水平分別顯著高于中-高分化類型、T1～T2和TNM分期為I～II期的患者(P＜0.01)。由此推測，miRNA-183 可能成為胃癌病情評估和診斷的重要分子標志物。同時，本研究中血清miRNA-183 水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、淋巴結轉移均無明顯相關，因此，血清miRNA-183水平在反映原發性腫瘤病灶、淋巴結轉移及其他疾病特征方面受到限制。原因可能與研究樣本量小有關。目前，有研究表明，miR-183-5p通過干預基因表達促進腫瘤進展，與癌癥患者的預后相關。例如，Li等[15]的研究表明，miR-183-5p在胃癌組織和細胞系中表達下調，其表達水平與TNM 分期、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移相關，這與本研究結果相似。miR-183-5p在甲狀腺癌中的高表達促進腫瘤細胞的轉移和抗凋亡[16]；此外，Yan 等[l7]的研究認為miR-183-5p在肝癌細胞和組織中高表達，并與一些臨床病理指標相關。但是，目前關于miRNA-183促進胃癌發生發展的具體機制仍在探索之中，仍需要進一步的研究來驗證。

已知多種糖類抗原以及CEA均為診斷胃癌的生物標記物，但它們的敏感性和特異性不高。本研究中單獨應用CA199 診斷胃癌的敏感度和特異度分別為53.8%和87.5%，與蔡曉娟等[18-19]研究結果相近。在臨床診斷中ROC 曲線下面積＞0.9 表示診斷價值高，0.7～0.9 表示診斷價值較好，0.5～0.7 表示診斷價值較低[20]。本研究CA199 診斷胃癌的AUC 為0.724，診斷價值并不高，單獨檢測CA199 不足以預測胃癌。因此，CA199 指標聯合其他分子標記物的檢測已成為目前提升胃癌診斷準確性的新型研究方向。本研究另一結果表明miRNA-183 診斷胃癌敏感度和特異度為67.31%和80%，AUC 為0.771。雖然miRNA-183 單獨診斷胃癌的特異度和敏感度并不令人滿意，但是當miRNA-183 與CA199 聯合檢測后診斷胃癌的敏感度及特異度提升至76.92%和87.5%，AUC為0.882。因此，在胃癌診斷中將miRNA-183與CA199聯合應用可能有助于胃癌的臨床篩查和輔助診斷。

另外，本研究的生存分析結果顯示，miRNA-183高表達組患者生存時間明顯短于miRNA-183 低表達組，而且miRNA-183與CA199均高表達的患者預后更差，提示兩者的高表達代表胃癌的進展程度和預后的惡化，預示著miRNA-183和CA199可以作為聯合生物標志物，用于胃癌患者的預后預測。

綜上所述，由于胃癌患者血清中miRNA-183的表達水平明顯高于胃部良性病變患者，與CA199聯合檢測可提高診斷效率。此外，胃癌血清中miRNA-183的表達水平與腫瘤的T分期、TNM 分期、組織學分級以及患者的預后相關，因此miRNA-183 對于胃癌診斷、病情評估、預后有著較高的臨床價值，但這一結果還需要大樣本研究的證實。