白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢的代謝組比較分析

史紹琪，陳金甜，林毓娥，謝國源，黃美華，王 敏

（1.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣寧縣江屯鎮農業技術推廣中心，廣東 廣寧 526334；3.廣寧縣農業農村局，廣東 廣寧 526300；4.肇慶市農業科學研究所，廣東 肇慶 526000）

【 研究意義】 佛手瓜（Sechium eduleSwartz）為葫蘆科佛手瓜屬多年生宿根性攀援植物，廣泛分布于熱帶及溫帶地區，是一種常見的瓜類蔬菜［1］。佛手瓜原產于墨西哥，19 世紀初傳入我國臺灣地區，目前在廣東、云南、浙江、福建、臺灣等地廣泛種植［2-3］。佛手瓜是一種營養豐富的珍稀蔬果，具有舒肝理氣、和胃止痛、美容養顏和擴張血管、降壓的功效［4-5］。龍須菜是佛手瓜的嫩梢，20 世紀80 年代末，廣東肇慶廣寧縣開始種植［6-7］，其口感爽脆、風味獨特，兼具助消化、清熱解毒等保健作用，富含維生素B、維生素C、胡蘿卜素、總黃酮和礦質元素［8-10］，龍須菜鮮苗中含有豐富的蛋白質以及鈣、鐵、硒等元素，其含量均高于其他蔬菜［11］。雖然龍須菜營養價值較高，但有關其代謝組學研究方面尚未見報道。【前人研究進展】代謝組學（Metabonomics）可用于代謝途徑或代謝網絡解析，是定量評價果蔬品質的有效途徑之一［12-14］。目前，代謝組學已在水稻［15-16］、玉米［17］、擬南芥［18］、番茄［19］、萵苣［20］、大豆［21］和甜瓜［22］等作物得到應用，并為其他物種代謝物積累模式和遺傳基礎研究提供參考。研究者從表型與脂質分子層面對不同花生品種進行品質鑒評，最終篩選到3類31 種核心差異脂質分子，在花生品種鑒定中發揮關鍵作用［23］。赤霞珠是釀酒葡萄的主要栽培品種，研究者對赤霞珠果皮不同砧穗組合進行代謝組分析，成功鑒定出赤霞珠葡萄6 種砧穗組合特征標志物，為葡萄砧木良種選育提供方向［24］。研究發現，蔗糖、葫蘆素、脂質等差異代謝物可作為標記性物質區分不同類型西瓜品種，為西瓜育種奠定基礎［25］。不同瓠瓜果實間存在較大的代謝物差異，脂質、氨基酸、黃酮類物質綜合影響瓠瓜果實鮮味［26］。【本研究切入點】白皮和江屯青皮佛手瓜的果實皮色差異明顯，但其嫩梢表型差異肉眼無法辨別，且嫩梢的代謝物組成和含量尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢為材料，鑒定不同龍須菜品種中差異代謝物質，為佛手瓜嫩梢的品質改良和有效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為成熟期白皮和江屯青皮佛手瓜，由肇慶市廣寧縣江屯鎮富竹莊園生態農場提供。2021 年春季，種植于廣東省農業科學院蔬菜研究所白云試驗基地。首先將成熟期白皮和江屯青皮佛手瓜整瓜分別種植于營養缽中，常規栽培管理，發芽后移栽至大田；主莖長至15 節左右時，分別摘取約3 cm 左右頂端新鮮嫩梢置于液氮中，每個品種選取9 個單株，摘取嫩梢，3 次重復，保存在-80℃冰箱。江屯青皮佛手瓜嫩梢（LXCB）作為對照，白皮佛手瓜嫩梢（LXCW）作為試驗組進行差異代謝物等數據分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 將樣品置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥；利用研磨儀（MM 400、Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取100 mg 粉末，在1.2 mL 70%甲醇提取液中溶解；每30 min 渦旋一次，每次持續30 s，6 次重復，樣本置于4℃冰箱過夜；12 000 r/min 轉速離心10 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，將樣品保存至進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。樣品（名稱分別為LXCW1、LXCW2、LXCW3 以及LXCB1、LXCB2、LXCB3）送至武漢邁維維爾生物科技有限公司進行廣泛靶向代謝組檢測。

1.2.2 色譜質譜 數據采集儀器系統包括超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）超高性能液相色譜分析儀（SHIMADZU Nexera X2）和串聯質譜（Tandem mass spectrometry，MS/MS）、4500 QTRAP 串 聯質譜儀（Applied Biosystems 4500 QTRAP）。

液相條件：色譜柱為Agilent SB-C18 柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A 為0.1%甲酸超純水溶液，流動相B 為加入0.1%甲酸的乙腈溶液；洗脫梯度為0 min 時，B 相比例為5%，9 min 內B 相比例線性增加到95%，持續1 min，10～11 min B 相比例降為5%，并平衡至14 min；柱溫40 ℃；流速0.35 mL/min；進樣量4 μL。

質譜條件主要包括：使用三重四極桿線性離子阱質譜儀（QTRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS 系統，該系統配備了ESI Turbo 離子噴霧接口，采用正負兩種離子模式進行數據采集。ESI源操作參數如下：離子噴霧電壓（IS）5 500 V（正離子模式）/-4500 V（負離子模式）；離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子源氣體I（GSI），氣體Ⅱ（GS Ⅱ）和氣簾氣（CUR）分別設置為50、60、25.0 psi，碰撞誘導電離參數設置為高。三重四極桿掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體（氮氣）設置為中等。

1.3 數據分析

利用軟件Analyst 1.6.3 處理質譜數據，再進行主成分（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），利用R 軟件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal 函數進行分析；代謝物含量數據采用歸一化處理（Unit Variance Scaling，UV Scaling），通過R 軟件ComplexHeatmap 包繪制熱圖，對代謝物在不同樣本間的積累模式進行層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）。

2 結果與分析

2.1 兩個佛手瓜品種嫩梢代謝組輪廓

利用MRM（三重四級桿質譜的多反應檢測模式）和MultiaQuant 軟件對白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢混合樣本進行數據采集和分析。結果表明，總離子流曲線重疊性高，即保留時間和峰強度一致，表明質譜對同一樣品的不同時間檢測信號穩定性較好。

通過對白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢進行廣泛靶向代謝組學檢測，共檢測到787 種代謝物，采用主成分分析建模方法對所鑒定代謝物進行分析。結果表明，當PC1為51.49%、PC2為19.75%時，不同品種能夠明顯分開，同一品系樣本沒有明顯分離，3 次重復數據能較好地集中，白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢代謝物明顯分離（圖1）。

圖1 兩個佛手瓜品種嫩梢PCA 得分Fig.1 Score plot of PCA analysis of the tender tips of two varieties of Sechium edule

2.2 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物篩選和鑒定

基于OPLS-DA 結果和差異倍數值（Fold Change，FC）分析，發現白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢中差異顯著代謝物共有135 種。與江屯青皮佛手瓜嫩梢相比，白皮佛手瓜嫩梢中顯著上調53種，包括脂質18 種、酚酸類11 種、黃酮7 種、核苷酸及其衍生物6 種、氨基酸及其衍生物4 種和其他7 種代謝物；顯著下調代謝物為82 種，包括黃酮29 種、脂質31 種、生物堿7 種、酚酸類5 種和其他10 種代謝物（表1）。

表1 白皮佛手瓜與江屯青皮佛手瓜嫩梢部分顯著差異的代謝物 Table 1 Metabolites with significant differences between the tender tips of white Sechium edule and Jiangtun cyan Sechium edule

2.3 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物聚類分析

采用聚類分析方法對兩個佛手瓜品種嫩梢進行差異代謝物分析。結果表明，白皮佛手瓜嫩梢中的芥子醛、松柏醇、苜蓿素-7-O-（2''-芥子酰）葡萄糖苷、5-羥基-7,8,2'，6'-四甲氧基黃酮、二氫雙去甲氧基姜黃素、十八碳二烯-6-炔酸、9-羥基過氧-10E,12,15Z-十八碳三烯酸、1-O-葡萄9 糖基芥子酸、香草醛;4-羥基-3-甲氧基苯甲醛、9-羥基-13-氧代-10-十八碳烯酸等代謝物含量比江屯青皮嫩梢高。江屯青皮佛手瓜嫩梢中的溶血磷脂酰乙醇胺16 ∶3、溶血磷脂酰膽堿16 ∶1、N',N''-二阿魏酰亞精胺、日當藥黃素、吲哚-3-氰基-2-O-葡萄糖苷、3-O-對香豆酰奎寧酸-O-葡萄糖苷、腺嘌呤核苷三磷酸、溶血磷脂酰乙醇胺18 ∶1、山奈酚-3,7-O-二鼠李糖苷（山奈苷）、溶血磷脂酰膽堿18 ∶1 含量較高（圖2）。

圖2 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物聚類分析Fig.2 Cluster analysis of differential metabolites in tender tips of two varieties of Sechium edule

2.4 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物代謝途徑分析

根據差異代謝物聚類分析結果，開展KEGG通路富集分析。結果顯示，差異代謝物主要顯著富集在嘌呤代謝、亞油酸新陳代謝、類黃酮生物合成、各種次生代謝產物生物合成和亞麻酸新陳代謝5 條途徑中（圖3）。嘌呤代謝富集6 種物質，包含3'-腺嘌呤核苷酸、次黃嘌呤、腺嘌呤核苷三磷酸、腺苷-5'-單磷酸、腺苷和鳥苷 5'-單磷酸，占比16.22%；亞油酸新陳代謝富集7 種物質，包括9S-羥基-10E,12Z-十八碳二烯酸、13-羥基十八烷基-9,11-二烯酸、9(S),12(S),13(S)-三羥基-10(E)-十八烯酸、13-氫過氧化-9,11-十八碳二烯酸、9,10-環氧十八烯酸、9S-氫過氧-10E,12Z-十八碳二烯酸和9,10,13-三羥基-11-十八碳烯酸，占比18.92%；類黃酮生物合成富集5 種物質，包含3-O-乙酰短葉松黃烷酮、3,4,2',4',6'-五羥基查耳酮-4'-O-葡萄糖苷、圣草酚、5-O-對香豆酰奎寧酸和短葉松素，占比13.51%；各種次生代謝產物生物合成富集5種，包含松脂醇、腺嘌呤核苷三磷酸、香草醛；4-羥基-3-甲氧基苯甲醛、松柏醇和鄰氨基苯甲酸，占比13.51%；α-亞麻酸新陳代謝富集3 種，包含13S-羥基-9Z,11E,15Z-十八碳三烯酸、9-羥基過氧-10E,12,15Z-十八碳三烯酸和9-羥基-12-氧代-10(E),15(Z)-十八碳二烯酸，占比8.11%。

圖3 兩個佛手瓜品種嫩梢差異代謝物KEGG 富集Fig.3 Differential metabolite KEGG enrichment of tender tips of the two varieties Sechium edule

3 討論

代謝組學在植物學、醫學、食品科學、農業害蟲防治等領域都得到廣泛應用［27-29］，利用代謝組學方法可以將代謝物的種類與含量、生物表型變化建立更直接的聯系［30］。伍海航等［31］利用多組學技術研究了藥用植物中次生代謝調控，分析了多組學聯用與黃酮類、生物堿類等成分間的次生代謝物差異，進一步解析了藥用植物調控網絡。杜尚廣［32］利用代謝組學分析兩種水稻在寒冷條件下代謝物差異，發現糖類和氨基酸類物質響應兩種水稻的低溫脅迫，并為水稻抗寒品種選育提供理論依據。袁平麗［33］對不同西瓜果實代謝物進行檢測，發現西瓜栽培種和野生種的代謝輪廓存在明顯差異，在馴化過程中糖類物質和類胡蘿卜素含量逐漸升高，抗營養類物質含量逐漸減少，為優質西瓜新品種選育提供了思路。

研究表明，脂質類溶血磷脂酰乙醇胺可以緩解腸道炎癥，通過增加腸道上皮屏障的穩定性，緩解或治療腸炎和炎癥性腸病［34］；生物堿亞精胺類物質具有鎮痛、降血壓以及抗抑郁等作用［35］；酚酸類腺嘌呤核苷三磷酸可以保護心肌細胞［36］，這些物質可能是佛手瓜具有降血壓等藥用價值的關鍵。與白皮佛手瓜嫩梢相比，青皮佛手瓜嫩梢中含有豐富的溶血磷脂酰乙醇胺、阿魏酰亞精胺以及腺嘌呤核苷三磷酸，藥用價值更高。

黃酮類是果實鮮味的關鍵物質，具有抗菌、抗氧化活性功能［37］。研究表明，淡竹葉中日當藥黃素含量較高，可以抑制黑色素積累，具有較強的抗氧化活性［38-39］，本研究發現江屯青皮與白皮佛手瓜嫩梢山奈苷、日當藥黃素均有顯著性差異，二者皆屬于黃酮類，推測其具有一定的抗氧化能力，可能參與調控佛手瓜的鮮味，影響其營養品質。江屯青皮佛手瓜嫩梢含有更為豐富的黃酮類物質，在鮮味、抗氧化等品質方面更好。

4 結論

本研究通過代謝組學比較白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢的差異代謝物，共篩選到135 種顯著差異物質，差異倍數log2處理后，溶血磷脂酰乙醇胺和日當藥黃素log2FC 值分別為-19.21 和-14.31，表明江屯青皮龍須菜富含脂質和黃酮類物質，特別是溶血磷脂酰乙醇胺、日當藥黃素等，為解析青皮龍須菜代謝組學的營養價值以及輔助龍須菜的品種選育提供理論基礎。